摘要：抑菌肽相比傳統藥物，具有低毒滅菌、對多重耐藥菌有效、生物相容性好等優點。近些年來，抑菌肽奇特的細胞膜靶點作用機制得到了深入研究，基于此機制上的結構優化策略也成為了近日研究熱點。本文主要針對抗菌肽的細胞膜損傷機制展開，就近期通過多肽替換、線性肽成環、化學修飾、多聚化、抗生素偶聯以及復合材料制備等手段對抗菌肽結構給以優化的研究進展進行了總結，期望對抗菌肽設計與改構研究提供思路。
抑菌肽(,AMPs)，有時也被稱為寄主防御肽(host,HDPs)，是一種小分子氨基酸，一般由不到50個多肽殘基組成。抑菌肽具有低毒的抗微生物活性，不僅抑菌活性外，對細菌、寄生蟲與病毒也有活性[1-3]，再者，抑菌肽也被發覺具有其他多種生理功能，如免疫調節、促血管產生、促創口結疤和抗肺癌活性等[4-7]。天然抑菌肽來源廣泛，不僅人體外，在植物、植物、細菌、真菌乃至古生菌與原生植物中均發覺了天然的抑菌肽[8]。目前早已報導了超過4000種抑菌肽[9]，其中大多數為帶有正電荷、具有一定疏水性官能團的兩親性氨基酸，主要通過影響真菌細胞膜發揮抑菌作用。抑菌肽的構型多樣，可以是α-螺旋、β-折疊，線性延伸或無規則蜷曲，也可以是環肽或上述多種官能團的混和，但大部份抑菌肽的構型為α-螺旋或β-折疊。因為現今微生物對傳統藥物的耐藥性越來越強，臨床對新型抑菌抗生素需求迫切，而抑菌肽由于具有與傳統藥物所不同的抑菌機制，成為了一種擁有巨大潛力的新型抑菌分子類別，在近些年來遭到了廣泛關注，但是在真菌感染、傷口結疤與發炎醫治等方面都具有臨床應用前景[10-11]。本文從傳統藥物與抑菌肽的抑菌機制出發，剖析了抑菌肽基于細胞膜損傷機制的抑菌構效關系，并對近些年來基于細胞膜損傷機制的一些抑菌肽結構優化策略研究進展進行了介紹。
1傳統藥物與抑菌肽的抑菌機制
傳統藥物一般是通過5種途徑實現對病原真菌的功擊[12]：①抑制真菌細胞壁的合成(β-內丙酯類藥物等)；②抑制真菌蛋白質合成(地塞米松等)；③直接或間接抑制核苷酸(DNA/RNA)的合成或復制(利福霉素、磺胺類藥物等)；④靶向細胞膜(多黏菌素等)；⑤前4種機制與藥物誘導的應激反應協同作用，如DNA修補的SOS應答氧化應激等(β-內丙酯類藥物等)。而針對上述作用機制，具有抗藥性的真菌進化出了對應的藥物抵抗機制[13-15]：①產生使抑菌抗生素失活的酶(針對β-內丙酯藥物等)；②通過外排泵將藥物泵出菌體外(針對黃連素等)；③改變原先對藥物的作用靶位(針對β-內丙酯藥物等)以及增加真菌細胞膜私密性、改變代謝通路等機制。面對具有多種耐藥機制的超級真菌，傳統藥物的抑菌療效大大減少。
抑菌肽的抑菌機制主要通過細胞膜與細胞內兩種途徑實現[15-16]。抑菌肽的細胞內途徑與傳統的藥物作用機制相像，主要通過與真菌細胞內的各類大分子互相作用而影響細胞功能來實現，如影響核苷酸復制、蛋白質合成、影響酶活性和細胞壁生成等[15-16]。
細胞膜途徑是抑菌肽的主要抑菌途徑，也是其與傳統藥物不同的特有途徑。帶有正電荷的抑菌肽與真菌帶有負電荷的細胞膜通過靜電吸附相結合，集聚在真菌細胞膜表面；抑菌肽兩親性結構中的疏水部份與細胞膜磷脂互相作用，破壞真菌的細胞膜，引起細胞死亡，進而實現抑菌。對于抗菌肽與真菌細胞膜的互相作用機制，目前還未能完全闡述，有多種常見的模型假說[16]，如桶-板模型、環-孔模型、地毯模型和集聚模型。在桶-板模型中[17]，隨著抑菌肽在細胞膜表面集聚，其垂直插入脂類雙分子層中，疏水部份朝外，親水部份朝內產生通道，導致細胞內物質流出；環-孔模型與桶-板模型相像[17]，不同的是在環-孔模型中抑菌肽的疏水部份與細胞膜脂類層相結合，共同環繞著富含抑菌肽親水部份的凹坑；在地毯模型中[18]，抑菌肽完全平行覆蓋在細胞膜表面，隨著抑菌肽不斷集聚，細胞膜磷質層穩定性增加，最后完全被抑菌肽覆蓋并斷裂；在集聚模型中[19]，抑菌肽與細胞膜互相結合，覆蓋細胞膜造成其斷裂的同時也產生造成細胞內物質泄露的孔道，這種孔道會進一步幫助抑菌肽步入細胞內，實現與傳統藥物分子相像的對核苷酸、蛋白質、酶等合成進行抑制的功能。無論是哪種模型，抑菌肽都還能使細胞膜穿透性大大降低，引起細胞溶化、胞內物質流出，引起細胞死亡。抑菌肽通過細胞膜途徑引起真菌細胞死亡的生物活性與其結構密切相關，對抗菌肽的結構特征上的研究早已有了一定成果。
2抑菌肽的結構-生物活性關系
抑菌肽的抑菌活性與其結構聯系緊密，這些基于細胞膜損傷機制的抑菌活性為抑菌肽結構修飾優化提供了方向，其中在結構上對抗菌活性影響較大的幾個誘因包括電荷數、疏水性、螺旋度與兩親性等。
適當降低抑菌肽的正電荷數才能提升其抑菌活性[20]。絕大部份抑菌肽在中性pH下都為陽離子型，帶正電荷，借此通過靜電互相作用附著在真菌帶負電的細胞表面。據悉，正電荷還能否使抑菌肽與細胞膜脂寡糖上的Ca2+、Mg2+結合位點結合，深入細胞膜內部，進一步破壞細胞膜結構[21]。真菌細胞的脂類膜作為抑菌肽作用的主要靶向，抑菌肽的疏水性對其與脂類膜的互相作用有著重要影響。通過引入疏水性殘基細胞膜損傷，提升抑菌肽的疏水性，可以提升其抑菌活性。但過強的疏水性也會引起抑菌肽的自我集聚，增加其溶化度與抑菌活性[22]。大多數的抑菌肽有著α-螺旋的二級結構，抑菌肽在α-螺旋下才能更好地與細胞膜相結合，因而抑菌肽的螺旋度被覺得與其抑菌活性有較強的相關性[22]。最后，兩親性是絕大多數抑菌肽具有的特點，其本身也是抑菌肽在電荷數與疏水性上取得平衡的結果，意味著抑菌肽既才能通過親水域的靜電作用吸附在細胞膜，也可以通過疏水域與細胞膜的互相作用溶入膜結構中，呈現抑菌活性。
3抑菌肽的近日臨床前結構優化研究進展
針對上述幾個方面，通過優化抑菌肽的多肽序列就能改善其抑菌活性。據悉，其他的物理修飾手段，如C端丙酯化、N端胺基化、訂合成環(借助小分子聯接子，共價交聯不同位置多肽的胺基，提升氨基酸穩定性等屬性)、烷基鏈引入等方式[23-24]也被廣泛應用于抑菌肽結構整修，借此達到高抑菌活性、提高氨基酸穩定性和減少溶血毒性等目的。下文將會介紹近些年來通過疏水性、正電荷調整和其他物理修飾手段對抗菌肽進行優化的臨床前研究進展。
3.1多肽替換
對抗菌肽序列中的多肽進行替換、優化，借此調控氨基酸電荷、疏水性和二級結構等屬性，進而實現更好的抑菌療效、更低的毒性或更高的穩定性，仍然是抑菌肽臨床前研究中的主要內容。等[25]通過對人源抑菌肽LL37上C端的24個多肽序列進行隨機替換和計算機活性預測，再將序列中的谷氨丙酯替換為陽離子的賴谷氨酸或精谷氨酸，增強其正電荷數和螺旋度，篩選合成了25個氨基酸衍生物，其中的抑菌肽對多種多重耐藥菌都具有良好的抑菌療效，其在50%血清中對金紅色獼猴桃桿菌的99.9%滅菌含量LC99.9可達1.6~12.8μmol/L，而改構原型LL-37的相應LC99.9則要小于204.8μmol/L。在血清中的滅菌療效優于多種臨床前和臨床研究階段的抑菌肽抗菌水平。
Deber等[26]從稀有的含連續多個陽離子多肽序列的天然抑菌肽出發，設計合成了富含“陽離子簇”的抑菌肽6K-F17，通過改換賴谷氨酸位置改變該氨基酸電荷分布，調整其兩親性，以探究兩親性對生物活性的影響。研究發覺，即使電荷分布更平均、兩親性更好的結構具有更高的抑菌活性，但對人體正常細胞的毒性也會急劇降低，且抗酶解穩定性也會升高。N端富含連續6個賴谷氨酸，正電荷集中的6K-F17破壞真菌細胞膜能力強，對人細胞毒性低，有著更好的抑菌選擇性。6K-F17對銅綠假單胞菌的MIC為3.1~25μmol/L，而6個賴谷氨酸分散在氨基酸序列中的1K-5K抑菌肽的相應MIC則為25~>50μmol/L。6K-F17也擁有更低的毒性和更好的氨基酸穩定性，在其40μmol/L含量下未觀察到細胞溶血，且在血清中保留24h后抑菌肽濃度仍然無減輕。
倪京滿等[27]基于蛇毒抑菌肽設計合成了一系列疏水或親水多肽替換的短鏈衍生物，對衍生物的生物活性與其正電荷、疏水性、兩親性和二級結構間的關系進行剖析，發覺這種衍生物的陽離子多肽與疏水多肽各自分布在α-螺旋二級結構的疏水面與親水面上。作者總結了抑菌肽衍生物疏水性分別對革蘭陽性和陰性菌抑菌活性的影響，篩選出了具有最高抑菌活性和廣譜性的抑菌肽A-21，其對金紅色獼猴桃桿菌和鮑曼不動弧菌的MIC95可達4~8μmol/L，優于的256~512μmol/L；同時A-21的最低溶血含量MHC(抑菌肽引起10%人血紅細胞溶血所需含量)為134.38μmol/L，溶血毒性較低。
單田鎮等[28]借助甘氨酸基團上吡啶pH敏感的質子化性質，以西非蜈蚣毒素中的抑菌肽為模板，使用谷氨酸取代賴谷氨酸設計并篩選出了具有堿性pH響應能力的抑菌肽F5。抑菌肽F5在pH7.4的生理pH下對革蘭陽性菌的滅菌能力微弱，MIC>64μmol/L，而在pH6.5的微酸性pH下相應抑菌活性顯著提高，MIC可達2~16μmol/L。據悉，模板在pH7.4或6.5時MHC為16或2μmol/L，而F5的MHC要小于128μmol/L。在發炎環境下細胞膜損傷，F5可以有效殺傷處于堿性pH中的有害病菌，同時避開了對正常生理pH中有益共生菌的傷害。
3.2線性肽成環
不僅常規的多肽替換優化方式，將線性肽通過二硫鍵、訂合等方式成環的手段在提升抑菌肽活性、穩定性等方面也有著廣泛應用。賴仞等[29]以金環蜂毒中的抑菌肽衍生物-BF15為基礎，使用色谷氨酸與賴谷氨酸替換原氨基酸中的所有苯丙谷氨酸、絲氨酸和亮谷氨酸，再插入半胱谷氨酸(Cys)成環，得到了具有保留強效抑菌活性、低溶血性的同時具有更高穩定性的抑菌肽ZY4，其對具有多重耐藥性的銅綠假單胞菌和鮑曼不動球菌造成的MIC可達0.8~4.0μmol/L；而ZY4的MHC小于320μg/mL，溶血毒性較低。據悉，在血清中保存10h后，ZY4仍然有91%保持結構穩定。
等[30]對天然抑菌肽蛙皮素II進行訂合修飾，篩選了不同位點的i+4與i+7(將i與i+4或i與i+7位兩個多肽的胺基聯接)訂合肽，對比其抑菌活性與紅細胞溶血度，并對不同位點訂合的抑菌肽疏水面進行剖析，結合計算機輔助設計了抑菌肽篩選算法。通過算法確定在15位多肽訂合后，再依照算法使用賴谷氨酸掃描在9位將谷氨酸替換為賴谷氨酸(A9K)，使其在25μg/mL含量時的細胞溶血由13%增加到3%。然后作者再對已有訂合肽在細胞膜上產生環-孔的具體機制進行了剖析，以建立算法。作者進一步在Mag(i+4)15(A9K)的基礎上，在1位多肽上降低一處訂合以提升穩定性，最后對剩余位點多肽進行替換調整，通過算法幫助篩選出了具有最優的抗多重耐藥菌活性、低溶血性、低毒性和高穩定性的雙訂合抑菌肽Mag(i+4)1,15(A9K,B21A,N22K,S23K)，其對銅綠假單胞菌的MIC可達1.56μg/mL，而篩選前Mag2抑菌肽的相應MIC則小于50μg/mL。
3.3非多肽結構引入的物理修飾
向氨基酸中引入非多肽結構(如脂肪鏈等)來實現對抗菌肽性能的調控也是常用的技巧之一。等[31]將C2-C14?；溁蚍枷悱h引入人源抑菌肽LL37的片斷肽KR12-NH2的N端，以研究這些親脂性修飾對抗菌活性和溶血性的影響。研究發覺，在適當厚度范圍(C6-C12)內，N端氨基鏈修飾才能降低KR12-NH2的抑菌活性；但過長?；溞揎?C14)的氨基酸會自組裝為更大的集聚結構，反倒會造成抑菌活性增長。經過對比，抑菌活性與溶血性取得平衡的最優結構為C8酰基鏈N端修飾的抑菌肽C8-KR12-NH2，其對于金紅色獼猴桃桿菌的MIC可達2~4μg/mL，而無巰基鏈修飾的Ac-KR12-NH2相應MIC小于256μg/mL。同時，C8-KR12-NH2的MHC為64μg/mL，而更長?；?C10-C14)修飾的KR12-NH2在相同含量下則會引起85%~100%的細胞溶血。
3.4單體多聚化
將單體抑菌肽二聚化或多聚化對擴充低毒性、提高抑菌活性和穩定性都有一定幫助，是一種有效的修飾手段。Wade等[32]通過二硫鍵、二乙酯或全氟苯聯接Cys的方式,對先期研究中通過各類物理修飾手段得到的富脯谷氨酸抑菌肽Chex1-Arg20進行了二聚化。研究發覺，使用四氟苯和八氟吡啶聯接的抑菌肽二聚體對多重耐藥的鮑曼不動鏈球菌和的抑菌活性分別可達5μg/mL和13.5μg/mL，而Chex1-Arg20單體的相應抑菌活性為200μg/mL和小于250μg/mL。據悉，Chex1-Arg20二聚體還被發覺才能減輕真菌感染引起的發炎和提升寄主先天免疫。
3.5抑菌肽與小分子藥物偶聯
將抑菌肽與小分子藥物通過聯接子進行共價偶聯，借助抑菌肽靶點真菌細胞膜，再切斷抑菌肽與藥物間的共價聯接釋放活性小分子藥物，還能同時結合小分子的細胞內滅菌功能與抑菌肽的低毒滅菌和針對多重耐藥菌的高活性特性，獲得比以上二者單純聯用更好的抑菌療效。等[33]在爪蟾抑菌肽類似肽9P2-2和富脯谷氨酸抑菌肽兩種氨基酸的端與N端分別引入Cys，再通過二硫鍵或酸酐鍵與氨芐西林衍生分子共價聯接，得到了可切斷或不可切斷的抑菌肽-小分子藥物偶聯分子。通過篩選發覺，9P2-2在N端引入Cys后再通過二硫鍵聯接氨芐西林衍生分子的偶聯分子Amp-SS-9P2-2在抗革蘭陽性菌的活性上有著明顯增強。針對具有耐藥性的鮑曼不動弧菌，Amp-SS-9P2-2的MIC可達2.5μmol/L，高于單獨使用氨芐西林時的320μmol/L或單獨使用9P2-2的10μmol/L，而同劑量的氨芐西林與9P2-2單純聯用時MIC也只能達到10μmol/L。
3.6與其他材料聚合
將抑菌肽與其他材料相聚合，產生復合材料，可以突出抑菌肽的低毒抑菌優勢，填補其價錢較高昂、具有潛在毒性等缺陷，并同時實現其他材料的功能。程飚等[34]將抑菌肽通過端基與異戊二烯的酰基與透明質酸(HA)的甲基通過酯化反應結合，再與氧化藍莓糖(ODEX)和富血小板血清簇(PRP)通過席夫堿交聯制成水凝膠ODEX/HA-AMP/PRP，用以幫助慢性感染的創口結疤。這些包含抑菌肽在內的多組分水凝膠將各組分功能整合，在包裹創口后可以平緩釋放抑菌肽和PRP，通過抑菌肽滅鼠真菌減輕發炎，通過PRP推動膠原增殖收縮和血管生成。在糖尿病創口感染的大鼠模型中，ODEX/HA-AMP/PRP顯著抑制了創口處的真菌生長，處理3d時創口處的銅綠假單胞菌和金黃獼猴桃桿菌數目為106數目級，顯著優于單純紗布包扎處理情況下的108數目級；ODEX/HA-AMP/PRP也推動了創口結疤速率，處理14d的創口面積減少為開始的10%左右，顯著優于單純紗布包扎處理情況下的50%。
3.7引入納米載體
最后，使用納米載體加載抑菌肽用于體內遞送，才能克服抑菌肽的酶解不穩定性和脫靶毒性等缺點，進而提升抑菌肽的藥代動力學與藥效數據[35]。Lee等[36]使用DSPE-PEG修飾HnMc抑菌肽中Cys的羧基氨基，再將修飾后的DSPE-PEG-HnMc與PLGA-PEG以質量比2:8共同自組裝，產生了平均粒徑為60nm的HnMc納米絡合物。該納米絡合物中，疏水的PLGA與DSPE被包裹在絡合物中心，親水的PEG和HnMc抑菌肽分布在表面，從而可以主動靶點并破壞真菌的細胞膜；而同在微球表面的PEG鏈則可以保護HnMc抑菌肽免受非特異性蛋白的吸附和降解。HnMc納米絡合物在0.1mg/mL的含量下也就能對耐藥的銅綠假單胞菌和金黃獼猴桃桿菌實現80%的生長抑制療效；HnMc納米絡合物的MHC為1mg/mL，毒性較低；在耐藥銅綠假單胞菌腦部感染的大鼠模型中，HnMc納米絡合物成功延長了大鼠的生存時間，在2.5mg/kg劑量下生存時間由不經處理的6d延長到16d以上。
上述研究中所涉及的多肽序列及修飾手段總結可見表1。不僅以上提到的多肽替換或物理修飾手段外，使用D構象或其他非天然多肽替換、聚乙二醇或糖基化修飾等方式均為抑菌肽結構優化常見思路[12,37]。
4推論與展望
本文主要綜述了抑菌肽作用機理、結構優化思路和近些年來的臨床前研究進展。相較于傳統藥物，抑菌肽主要針對細胞膜的作用機制在抑菌低毒性與抗多重耐藥性上具有顯著優勢。通過多種修飾手段對抗菌肽進行結構優化的思路，如物理修飾和計算機輔助篩選等方式，在抑菌肽研究中早已得到了廣泛應用。雖然上述結構優化手段在臨床和產業化階段應用還未全面推廣，但隨著針對耐藥菌的新型抑菌抗生素需求的不斷減小，具有低毒性、對耐藥菌高活性和高生物相容性優點的抑菌肽將來必然會成為臨床研究熱點。
