微生物檢驗(yàn)必須把握的三大耐藥機(jī)制
你曉得哪些是微生物檢驗(yàn)嗎?你對微生物檢驗(yàn)了解嗎?下邊是我為你們帶來的關(guān)于微生物檢驗(yàn)必需要曉得的三大耐藥機(jī)制的知識，歡迎閱讀。
一、產(chǎn)生滅活藥物的各類酶
1、β—內(nèi)丙酯酶(β-)
β—內(nèi)丙酯類藥物都共同具有一個(gè)核心β—內(nèi)丙酯環(huán)，其基本作用機(jī)制是與真菌的抗生素結(jié)合蛋白結(jié)合，進(jìn)而抑制真菌細(xì)胞壁的合成。形成β—內(nèi)丙酯酶是真菌對β-內(nèi)丙酯類抑菌抗生素形成耐藥的主要誘因。真菌形成的β-內(nèi)丙酯酶，可利用其分子中的谷氨酸活性位點(diǎn)，與β—內(nèi)丙酯環(huán)結(jié)合并打開β—內(nèi)丙酯環(huán)，造成抗生素失活。迄今為止報(bào)導(dǎo)的β—內(nèi)丙酯酶已超過300種，1995年Bush等將其分為四型：第1型為不被克拉維酸抑制的阿莫西林菌素酶;第2型為能被克拉維酸抑制的β-內(nèi)丙酯酶;第3型為不被所有β—內(nèi)丙酯酶抑制劑抑制的金屬β-內(nèi)丙酯酶(需Zn2+活化)?？杀灰叶匪聂人岷蚉-所抑制;第4型為不被克拉維酸抑制的抗生素酶。臨床常見的β—內(nèi)丙酯酶有超低毒β—內(nèi)丙酯酶、頭孢菌素酶(AmpC酶)和金屬酶。
(1)超低毒β-內(nèi)丙酯酶(-β-,ESBLs)
ESBLs是一類才能酯化抗生素類、頭孢菌素類及單環(huán)類藥物的β—內(nèi)丙酯酶，屬Bush分型中的2型β—內(nèi)丙酯酶，其活性能被個(gè)別β—內(nèi)丙酯酶抑制劑(棒酸、舒巴坦、他唑巴坦)所抑制。ESBLs主要由普通β-內(nèi)丙酯酶基因(TEM—1，TEM—2和SHV—1等)突變而至，其耐藥性多由引物介導(dǎo)。自1983年在美國首次發(fā)覺ESBLs以來，目前已報(bào)導(dǎo)的TEM類ESBIs已有90多種，SHV類ESBLs少于25種。TEM型和SHV型ESBLs主要發(fā)覺于麻疹克雷伯菌和大腸埃希菌，亦發(fā)覺于變型球菌屬、普羅威登斯菌屬和其他腸球菌科真菌。
國外近些年來隨著三代阿莫西林菌素的廣泛使用，產(chǎn)ESBLs菌的檢出率逐年降低。NCCLs規(guī)定，凡臨床分離的大腸埃希氏菌和克雷伯氏菌均應(yīng)檢測是否為產(chǎn)ESBLs弧菌;若形成，無論體外對第三代頭抱菌素、氨曲南的藥敏結(jié)果怎樣，均應(yīng)報(bào)告對三代阿莫西林菌素及氨曲南耐藥。另外，ESBLs菌種除了對β-內(nèi)丙酯類藥物有很高的耐藥率，并且對羥基香豆素類、喹喏酰基耐藥率也在60%左右，因而，臨床遇見由ESBLs造成的感染時(shí)，建議首選含β—內(nèi)丙酯酶抑制劑的復(fù)方藥物劑型或酸酐培南;對于阿莫西林吡肟等四代阿莫西林，尚有爭議，按照抑菌藥的PK/PD理論，適當(dāng)改變給藥劑量和給藥間隔。以使血藥含量超過真菌MIC的時(shí)間達(dá)40%給藥間隔以上，其實(shí)是有效的。
(2)阿莫西林菌素酶(AmpC酶)屆Bush分類中的1型(Ⅰ型)β—內(nèi)丙酯酶。
一般將其分為由染色體介導(dǎo)形成的AmpCβ—內(nèi)丙酯酶和由引物介導(dǎo)形成的AmpCβ—內(nèi)丙酯酶，后者的形成菌有陰溝腸球菌、銅綠假單胞菌等，前者主要由麻疹克雷伯氏菌和大腸埃希氏菌形成。AmpC酶可作用于大多數(shù)抗生素，第一、二、三代阿莫西林菌素和單環(huán)類藥物。而第四代阿莫西林菌素、碳青霉烯類不受該酶作用。該酶不能被β—內(nèi)丙酯酶抑制劑所抑制。AmpCβ—內(nèi)丙酯酶的形成有2種可能：①在誘導(dǎo)劑存在時(shí)暫時(shí)高水平形成，當(dāng)誘導(dǎo)劑不存在時(shí)，酶產(chǎn)值急劇下滑，三代阿莫西林菌素、棒酸和碳青霉烯類藥物是誘導(dǎo)型AmpC酶的強(qiáng)誘導(dǎo)劑;②染色體上控制酶抒發(fā)的基因發(fā)生突變，造成AmpC酶持續(xù)穩(wěn)定高水平抒發(fā)。由高產(chǎn)AmpC酶耐藥菌造成的感染死亡率很高。
實(shí)際上，所有的革蘭氏陽性菌都能形成染色體介導(dǎo)的AmpC阿莫西林菌素酶，在多數(shù)情況下為低水平抒發(fā);在腸球菌、檸檬酸鏈球菌、沙雷氏菌、銅綠假單胞菌中可高頻誘導(dǎo)形成，且常為高產(chǎn)突變株。當(dāng)臨床出現(xiàn)上述病菌感染，開始幾天三代阿莫西林菌素醫(yī)治敏感，而此后發(fā)生耐藥時(shí)，我們可懷疑為高產(chǎn)AmpC酶的真菌感染，四代阿莫西林菌素和碳青霉烯類藥物不受具影響，可供臨床選用。含酶抑制劑的復(fù)方劑型不能用于醫(yī)治產(chǎn)AmpC酶弧菌的感染。
(3)金屬酶(β-)
大部份β-內(nèi)丙酯酶的活性位點(diǎn)是谷氨酸殘基，但也有一小部份活性位點(diǎn)為金屬離子的酶類。第一個(gè)發(fā)覺的以金屬離子為活性中心的酶是由蠟樣芽抱球菌形成的阿莫西林菌素酶，能被EDTA所抑制，然后世界各地均發(fā)覺了能形成這類酶的各類病菌。1988年Bush首次將該酶定名為金屬β-內(nèi)丙酯酶(β-)，簡稱金屬酶。金屬β-內(nèi)丙酯酶耐受β—內(nèi)丙酯酶抑制劑且可酯化幾乎所有β—內(nèi)丙酯類藥物(包括吡啶培南)。該酶已在氣單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德氏菌中發(fā)覺，其中嗜麥芽窄食單胞菌的吡啶培南耐藥性由染色體介導(dǎo)，而脆弱擬鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌中引物介導(dǎo)的突變株在臺灣已有報(bào)導(dǎo)。由粘質(zhì)沙雷氏菌形成的金屬β—內(nèi)丙酯酶IMP-1型可在類似接合子的intl3上聯(lián)通，早已傳播到銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)堿鏈球菌。金屬酶可以酯化碳青霉烯類和近來開發(fā)的第四代阿莫西林菌素。金屬β-內(nèi)丙酯酶有廣泛傳播的潛力，對幾乎所有的β—內(nèi)丙酯類藥物均具有酯化活性，是目前所知的最強(qiáng)的β-內(nèi)丙酯酶-。
2、氨基糖苷修飾酶(或鈍化酶/滅活酶)
在真菌對羥基香豆素類藥物形成耐藥的機(jī)制中，修飾酶介導(dǎo)的耐藥最為流行，酶促修飾的羥基香豆素類藥物不能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)體靶位作用，因而喪失抑菌活性。修飾酶主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和核苷轉(zhuǎn)移酶。三類甲基香豆素修飾酶的作用機(jī)制各不相同：甲基轉(zhuǎn)移酶(AAC)修飾依賴于酰基輔酶A的N-甲基化：乙酸轉(zhuǎn)移酶(APH)修飾依賴于ATP的O-乙酸化;核酸轉(zhuǎn)移酶(ANT)修飾依賴于ATP的腺苷化。在革蘭氏陽性病原菌中，最常見的甲基香豆素修飾酶是AAC(6’)，使甲基香豆素類藥物1—、3—、2’—或6'—位甲基化，現(xiàn)在已發(fā)覺16種編碼AAC(6’)的基因。銅綠假單胞菌和腸球菌科真菌趨于于形成AAC(3)、AAC(6’)、ANT(2’’)以及APH(3’);藍(lán)莓桿菌和糞腸桿菌常常形成ANT(4’)(4’’)或雙功能的AAC(6’)/APH(2”)。獼猴桃桿菌對慶大霉素、卡那霉素和妥布霉素的`耐藥性和腸桿菌的高度慶大霉素耐藥性一般由雙功能酶介導(dǎo)，這種酶一般(但非總是)由坐落多重耐藥引物上的轉(zhuǎn)座子(Tn924)編碼，如藍(lán)莓桿菌具有的轉(zhuǎn)座子編碼的APH(3’)(提供卡那霉素、新霉素和阿米卡星耐藥性)，而其他的定位于染色體。越來越多的菌種可形成2種或更多種酶，對抗甲基香豆素類藥物。在過去幾年里常見的組合是慶大霉素修飾酶ANT(2’’)和AAC(3)]與AAC(6’)結(jié)合，造成對慶大霉素、妥布霉素、耐替米星、卡那霉素和阿米卡星的低毒耐藥性。
甲基香豆素類藥物對非發(fā)酵菌、腸球菌科及一些革蘭氏陰性桿菌均有挺好的抑菌活性，與β—內(nèi)丙酯類藥物聯(lián)用有協(xié)同抑菌作用，在感染醫(yī)治中占有重要地位。但因?yàn)橐陨夏退帣C(jī)制的存在，真菌耐藥問題也日趨嚴(yán)重，應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致注重，可喜的是阿米卡星等對MRSA和產(chǎn)ESBLs菌種仍保持17%-40%的敏感率。
二、改變抗生素作用靶位
1、青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的改變引起的β—內(nèi)丙酯類藥物耐藥
抗生素結(jié)合蛋白(PBP)參與了肽聚糖合成的最后階段。高分子量PBP經(jīng)常為多模塊，具有N末端糖基轉(zhuǎn)移酶區(qū)和C末端轉(zhuǎn)肽酶區(qū)。轉(zhuǎn)肽酶區(qū)的活性位點(diǎn)谷氨酸與酶的天然結(jié)構(gòu)相近，可與與β—內(nèi)丙酯類藥物發(fā)生不可逆酰化。鏈霉素結(jié)合蛋白(PBP)的改變常造成如下兩種臨床重要的耐藥表型。
(1)耐甲氧西林金紅色獼猴桃桿菌(-,MRSA)
MRSA是20世紀(jì)60年代美國首先報(bào)導(dǎo)的一種嚴(yán)重的臨床耐藥致病菌,20世紀(jì)80年代以來，世界各地都陸續(xù)發(fā)生MRSA診所感染的暴發(fā)流行，并逐年增多。MRSA耐藥分為固有耐藥和獲得性耐藥，固有耐藥是由染色體介導(dǎo)的，其耐藥性的形成是由于真菌形成一種特殊的抗生素結(jié)合蛋白PBP2a(或PBP2’)，分子量為78000的蛋白質(zhì)，與β內(nèi)丙酯類藥物的親和力降低，進(jìn)而造成真菌對β-內(nèi)丙酯類藥物耐藥。PBP2a由mecA基因編碼，95%以上的MRSA弧菌能測量到mecA基因，而敏感株則無。獲得性耐藥是由引物介導(dǎo)的，真菌獲得耐藥基因后，形成大量β-內(nèi)丙酯酶(而不是PBPs)，使耐酶抗生素平緩失活，表現(xiàn)出耐藥性，多為臨界耐藥。
在MRSA檢查過程中，凡屬M(fèi)RSA，不管其對其他β-內(nèi)丙酯類藥物MIC值或抗菌圈的大小細(xì)胞膜透性，實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)向臨床報(bào)告為對所有抗生素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、碳阿莫西林烯類和β內(nèi)丙酯類—酶抑制劑復(fù)合劑型耐藥，以免欺騙臨床服藥。MRSA感染的醫(yī)治是臨床非常棘手的困局之一，關(guān)鍵是其對許多藥物具有多重耐藥性，萬古霉素是目前臨床上醫(yī)治MRSA效果肯定的藥物，應(yīng)用30多年來未發(fā)覺耐藥弧菌。
(2)耐抗生素腦炎桿菌(,PRSP)
常年以來麻疹球菌對抗生素高度敏感。MIC在0.005-0.01mg/L之間。1967年美國首次報(bào)導(dǎo)耐抗生素麻疹球菌,MIC為0.5mg/L，隨后世界許多國家和地區(qū)均有報(bào)導(dǎo)，且耐藥率迅速上升。PRSP的耐藥機(jī)制百日咳桿菌的抗生素結(jié)合蛋白(PBP)發(fā)生改變，使其與抗生素的親和力降低。百日咳桿菌有6種PBP：1a、1b、2x、2a、2b和3，其中PBP2b最為重要，假如鏈霉素結(jié)合到PBP2b上并使之抑制即造成真菌溶化和死亡;反之，PBP2b發(fā)生突變，抗生素不能形成作用，則造成PRSP。在PRSP高耐菌種中(MIC≥2μg/m1)可有多達(dá)4種PBP(主要是1a、1b、2x、2b)同時(shí)發(fā)生改變[7]。
百日咳桿菌是造成社區(qū)獲得性氣胸的重要致病菌。目前，國外PRSP的發(fā)生率在4%左右，顯著高于亞洲國家細(xì)胞膜透性，在歐洲也屬于中等水平，且MIC多大于1mg/L，為此，在社區(qū)獲得性腦部感染病原菌中，PRSP尚不構(gòu)成嚴(yán)重恐嚇，抗生素仍可作為首選醫(yī)治抗生素。并且耐藥沒有國界，中國近日PRSP發(fā)生率尚低.但決不意味著不要注重，而是應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步強(qiáng)化PRSP的耐藥檢測。對于PRSP感染臨床診治推薦使用阿莫西林噻肟/阿莫西林曲松、新喹諾酸酯(如司帕沙星)。若屬PRSP嚴(yán)重感染則需應(yīng)用萬古霉素或加用甲硝唑。
2、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的改變導(dǎo)致喹諾酸酯藥物耐藥
喹諾酰基抗生素的作用機(jī)制主要是通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶而抑制DNA的合成，進(jìn)而發(fā)揮抗菌和滅菌作用。真菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶有I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，喹諾?；股氐闹饕饔冒形皇峭?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ又稱DNA促旋酶，參與DNA超螺旋的產(chǎn)生，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ則參與真菌子代染色質(zhì)分配到子代真菌中。革蘭氏陽性菌中DNA促旋酶是喹諾?；牡谝话形唬锾m氏陰性菌中拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ是第一靶位。
當(dāng)編碼組成DNA促旋酶的A亞單位和B亞單位及組成拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的parC和parE亞單位中任一亞基的基因發(fā)生突變均可導(dǎo)致喹諾硫醇的耐藥性。在所有的突變型中，以gyrA的突變?yōu)橹?，?0%左右，其次是gyrB、parC和parE突變。在所有那些突變類型中，若Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶上存在2個(gè)突變點(diǎn)(如gyrA和parC上)，它們造成對氟喹諾硫醇的耐藥遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于只有一個(gè)突變點(diǎn)(如gyrA或gyrB上)，后者是前者的3-4倍。同時(shí)沒有發(fā)覺突變僅出現(xiàn)在parC基因這一現(xiàn)象。這可能是由于DNA促旋酶是氟喹諾硫醇的重要靶位,gyrA亞單位的改變可導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化致空間位障，制止喹諾硫醇步入喹諾酸酯作用區(qū)，或造成化學(xué)物理變化，干擾喹諾酮與酶的互相作用。這種結(jié)果顯示gyrA上突變的出現(xiàn)是導(dǎo)致真菌對喹諾酰氯發(fā)生耐藥的主要機(jī)制，而parC突變只是進(jìn)一步導(dǎo)致銅綠假單胞菌對喹諾酮的高度耐藥。
DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的改變是真菌耐喹諾硫醇抑菌藥的主要機(jī)制，其他耐喹諾硫醇的機(jī)制還包括前面即將提到的真菌膜私密性改變和主動(dòng)外排機(jī)制。
三、細(xì)胞膜透性屏障和藥物主動(dòng)外排泵
真菌可以通過細(xì)胞壁的障礙或細(xì)胞膜私密性的改變，產(chǎn)生一道有效屏障，致使藥物未能步入細(xì)胞內(nèi)并達(dá)到作用靶位而發(fā)揮抑菌效能，這也是真菌在進(jìn)化與飼養(yǎng)過程中產(chǎn)生的一種防衛(wèi)機(jī)制。這類耐藥機(jī)制是非特異性的，主要見于革蘭氏陽性菌。由于革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁粘肽層外邊存在著類脂單層組成的外膜，內(nèi)層為脂寡糖，由緊密排列的碳氮分子組成，妨礙了疏水性抑菌藥步入菌體內(nèi)。另外真菌外膜上還存在著多種孔蛋白，分子較大者為OmpF，分子較小者為OmpC，它們可產(chǎn)生特異性通道(OprD)和非特異性的通道(OprF)，作為營養(yǎng)物質(zhì)和親水性抑菌抗生素的通道。抑菌抗生素分子越大，所帶負(fù)電荷越多，疏水性越強(qiáng)，則不易通過真菌外膜。真菌發(fā)生突變喪失某種特異孔蛋白后即可引起真菌耐藥性,另外因?yàn)橥饽さ鞍譕prF的缺位，使抗生素不易通過而形成耐藥性。如銅綠假單胞菌特異性孔蛋白OprD2缺位即造成碳青霉烯類藥物耐藥。
另外一種造成真菌非特異性耐藥的機(jī)制是真菌主動(dòng)外排泵的存在，可以將步入真菌體內(nèi)的抗生素泵出膜外，因而逃避藥物的作用。主動(dòng)外排系統(tǒng)因?yàn)槟芴禺惖貙⒉饺爰?xì)胞內(nèi)的多種抑菌抗生素主動(dòng)泵出細(xì)胞外，造成細(xì)胞獲得耐藥性。如大腸埃希氏菌中的多藥外排泵-TolC系統(tǒng)可以造成真菌對包括氯霉素、氯霉素、紅霉素、β—內(nèi)丙酯類、利福平、氟喹諾硫醇、氧化劑、有機(jī)溶劑、堿性顏料等多種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的抗生素耐藥。銅綠假單胞菌的MexAB-OprM系統(tǒng)的主動(dòng)外排作用也是造成銅綠假單胞菌固有的多重耐藥性的重要誘因之一。
真菌的膜耐藥機(jī)制主要表現(xiàn)在銅綠假單胞菌的多藥耐藥性。銅綠假單胞菌幾乎涵蓋了包括膜耐藥在內(nèi)的所有真菌耐藥機(jī)制，其耐藥已成為當(dāng)前感染醫(yī)治中較為棘手的問題之一，尤其值得注重和研究。
耐藥
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