-(APCs)forTumor-in
你們好，明天給你們帶來一篇2021年發表在AngewChemIntEdEngl的文章，作者來自于陸軍軍醫學院盛春泉課題組，題目為“-(APCs)forTumor-in”。研究人員開發了一種新型策略--共軛方式，以提升傳統的癌癥特異性靶點能力和體內抗肺癌效力。
背景介紹
蛋白酯化靶點嵌合體（）的開發正在成為一種前景寬廣的靶點蛋白降解策略。但是，因為膜滲透性差、體內藥效低和分布不均等誘因，使用異多功能分子進行抗生素開發普遍遭到限制。在此，研究人員開發了一種新型策略--共軛方式，以提升傳統的癌癥特異性靶點能力和體內抗肺癌效力。
作為概念驗證，通過可裂解聯接體將BET靶點與核苷酸適配體（AS）共軛，設計出了第一個適配體-共軛物（APC）。與未修飾的BET相比，所設計的分子（APR）在MCF7異種移植模型中顯示出更強的癌癥靶點能力，因而提高了體內BET降解和抗肺癌效力，并增加了毒性。為此，APC策略可為設計病變特異性靶點鋪平公路，并在基于的抗生素開發中具有廣泛的應用前景。
數據剖析
第一種-共軛物（APC）是通過用AS和可裂解聯接體修飾溴代主外膜（BET）而合理設計下來的。該共軛物對抒發堿基的MCF7甲狀腺癌細胞中的BET降解具有極好的特異性和強效作用。該APC的優勢還彰顯在其出眾的體內病變靶點能力、強大的抗肺癌效果以及降低對臟器的副作用。
APC策略可以改善傳統的水溶性、腫瘤靶點能力和抗肺癌效果，為克服其缺點提供了一種有價值的工具。
方案一:試劑和條件:a)二苯基-4-氧代-3,8,11,14-四氧雜-5-氮雜十六烷-16-酸，DIPEA，DMFrt，3h，產率75%。B)，DCM，rt，6h，產率82%。C)8(輔助資料計劃S1)，DIPEA海圖，DMF，rt，12小時，利潤率70%。4-甲基吡啶氯甲酮類，DMAP，DCM，rt，12h，產率65%。E)2,2’-二磺酰二(苯酚)，DMAP，DCM，rt，8h，產率68%。F)丁二羧酸，DMAP，dCM，rt，3h，產率85%。G)適體，Sulfo-NHS，EDCI，dd-H2O，DMF，0.5M/,12小時，豐度40-70%。
BET家族蛋白（BRD2、BRD3、BRD4和BRDT）是關鍵的表觀遺傳調節因子，可選擇性地辨識并結合甲基化組蛋白，進而將染色質轉化為適宜通過RNA聚合酶II（PolII）進行轉錄延展的氫鍵。
因為BET的數據非常可靠，因而一般被用作機理研究和方式開發的標準平臺。尤其是（下文中稱為化合物4，PRO；方案1）已被普遍用作模板分子，用于開發新的遞送策略。為此，試驗者選擇了強效BET（BRD4）降解劑PRO和核醇依賴性適配體AS進行APC概念驗證研究（圖1a）。
必須保持明晰的分子結構，能夠與目標蛋白和E3泛素酶產生三元復合物。為此，PRO結構中的聯接位點對APCs的設計尤為重要，APCs應能靶點輸送到癌癥細胞，然后通過分離聯接體釋放出原始PRO分子。PRO的結構剖析表明，VHL官能團富含一個游離胺基，這為引入聯接體和AS提供合適的附著位點
值得注意的是，這個甲基對于VHL的結合至關重要，在這個位置聯接聯接子和適配體將阻斷PRO的降解活性。因而，試驗者設計了一種酯基二硫聯接體，以確保PRO在細胞內的釋放（圖1b）。首先，AS可被抒發同位素的病變細胞選擇性辨識。最后，新產生的游離胺類可功擊碳酐酯鍵，釋放出PRO分子。
為了評估所設計的APC（化合物APR）的分布、穩定性和抗肺癌活性，還設計了一系列對照分子（圖1b）。我們選擇了代表非特異性DNA序列的胞吡啶寡核苷酸序列(CRO)作為AS的對照。設計的螢光素酰（讀“先”）胺（Fam）或吡啶3（Cy3）修飾可用于觀察共軛物的特異性靶點。
圖1.a)APC設計策略示意圖。APC的部份可選擇性地辨識細胞膜受體，并被病變細胞特異性地吸收。b)APC、成像分子和陽性對照的物理結構和設計原理。
AS的穩定性（圖2a）:
通過10%聚丙烯丙酯凝膠電泳（PAGE）評估了APR的穩定性。將ASCy3和放在含10%胎牛血漿（FBS）的培養基中，在37-38攝氏度下培養不同時間。與ASCy3一樣，在含血漿培養基中培養48小時后表現出穩定的特性。幾乎以完整的方式存在，這意味著用分子對AS進行末端修飾不會增加其穩定性。
驗證PRO是否能從APR中有效釋放:
作者構建了一種高效氣相色譜檢查方式，以評估PRO在還原條件（0.01M二硫蘇糖醇（DTT）在1×PBS緩沖液中，pH7.4，0.5%w/vTween80）下于378C的體外釋放情況（圖2b）。隨著孵育時間的延長，APR釋放的游離PRO量也在降低。因而，測量到的APR峰的硬度增加了，而測量到的PRO峰的硬度降低了（圖2）。PRO和峰值降低，這意味著在還原條件下，PRO成功地從APR體外釋放。
驗證MCF7細胞對APR的攝入和內化:
使用Cy3或共軛物進行了流式細胞術和共聚焦激光掃描顯微鏡檢查。AS特異性靶點細胞膜定位的同位素，同位素在MCF7卵巢癌細胞中過抒發，但在（正常人卵巢上皮細胞）細胞中沒有抒發。首先，流式細胞剖析表明，與MCF7細胞培養后，ASFam和的細胞攝入效率遠遠低于非選擇性的和結合物（圖2c）。相比之下，與對照細胞培養后，未觀察到Famm修飾的靶向寡核苷酸與非靶向寡核酸的螢光硬度有差別。這種結果否認了可被MCF7細胞特異性辨識。此后，我們通過激光共聚焦掃描顯微鏡闡述了APR的攝入和特異性。在用DAPI染色前，先用APRCy3、ASCy3和處理MCF7細胞1小時（也測量了樣品）。
圖2d顯示，用或ASCy3培養的細胞比用培養的細胞顯示出更強的藍色螢光。這種結果表明，AS共軛的APR也能保持良好的特異性同位素介導的內化作用。據悉，當MCF7細胞用EIPA（大針胞抑制劑）預處理時，與用抗生素對照處理的細胞相比，測量到的綠色螢光呈劑量依賴性增長（圖2e、g）。但是，用不同濃度的氯丙嗪（一種途徑抑制劑）或（一種山洞介導的內吞途徑抑制劑）預處理的MCF7細胞的細胞質中觀察到顯著的Cy3螢光訊號（圖2h、i）。這一差別表明，MCF7細胞主要是通過大蛋白胞吞作用攝入的。快速內吞機制可能為改善的細胞膜私密性提供了一種新策略。
圖2.a)含血漿培養基中ASCy3和隨時間變化的正態化含量；b)HPLC色譜圖示意圖，顯示APR在還原條件和非還原條件下的抗生素釋放曲線；c)MCF7細胞和細胞與500nMAS、APR、CRO和CPR培養；e)MCF7細胞經內細胞通路抑制劑（CA，山洞；CL，凝集素；M，大核細胞）預處理并與500nMAPR培養后的共聚焦顯微相片；f）物理抑制APR在MCF7細胞中的細胞內化。在對照實驗（無抑制劑，（f））的基礎上，使用三種內吞途徑抑制劑處理后，通過流式細胞儀評估Cy3的相對螢光：EIPA（大胞吞途徑)；g)（山洞介導的內吞途徑)；h）或（途徑）；i)偏差條
為了進一步研究APR的BET降解活性和BET同源物選擇性，作者用不同含量的APR和CPR（以PRO為對照）剌激MCF7細胞，進行了印跡剖析（圖3a-d)。
APR和PRO都能以含量依賴性方法有效降解BRD4，而在CPR處理的細胞中幾乎沒有觀察到BRD4降解。如圖3a和b所示，在50nM的含量下，APR只降解BRD4并達到絕佳的降解效率，而在相同的含量下，幾乎沒有觀察到BRD2和BRD3的降解。當含量降低到100nM時，APR介導的BRD2和BRD3降解率分別為65%和58%。當CPR含量降低到200nM時，在CPR組觀察到BRD4有輕微降解。這些結果驗證了APR在抒發堿基的MCF7細胞中降解BRD4的效率很高，但是AS修飾對原始PRO的降解活性影響很小。
ASM修飾共軛物對細胞毒性的影響：使用細胞計數試劑盒8（CCK8）測量法評估了APR對MCF7和MCF10A甲狀腺癌細胞的抗肺癌活性。在MCF7細胞中（圖3e、表S1和圖S3，見旁證信息），APR的抗增殖活性（IC50=56.9nM）與PRO（IC50=59.8nM）相當，顯著優于CPR（IC50=4.03mM）和AS（IC50=2.60mM）。相比之下，APR對細胞的細胞毒性顯著減少（IC50=3.13mM），遠高于PRO（IC50=0.67mM），與CPR（IC50=3.54mM）相當（圖3f）。
據悉，在測試范圍內，AS對據悉，在測試含量范圍內，AS對細胞的細胞毒性較弱（IC50=6.90mM）。這種結果表明，在抒發堿基的MCF7細胞中引入AS會造成的選擇性細胞毒性。值得注意的是，觀察到的選擇性可能是因為修飾與PRO固有特點的協同作用。
評估了APR對MCF7細胞自噬的影響（圖3g）:用100nMAPR和PRO處理MCF7細胞48小時后，MCF7細胞的自噬率分別為60.1%和60.1%。39.2%。但是，在相同條件下，CPR處理細胞的自噬率降至20.9%，顯著高于APR處理細胞的自噬率。對細胞自噬的影響與MCF7細胞增殖活性的增加是一致的。
圖3.a)印跡剖析化合物APR和PRO處理24小時后誘導MCF7細胞中BRD2和BRD3降解的療效；b)相同條件下化合物APR、PRO和CPR對MCF7細胞中BRD4水平的影響；c、d)使用(,US)對印跡結果進行定量剖析；e、f)通過CCK8檢查法確定APR、AS、CPR和PRO對靶MCF7細胞和非靶細胞的細胞毒性；g)用不同劑型處理的靶MCF7細胞的自噬情況。
為了測試APR的病變靶點特點:作者使用成像檢查法研究了在MCF7異種移植大鼠模型中的組織分布，并以ASCy3和CPRCy3作為對照。通過靜脈注射給藥后，剖析了ASCy3、和CPRCy3在癌癥和主要臟器（心、肝、脾、肺和腎）中的分布情況（圖4a）。給藥4小時后，處理大鼠肉瘤組織中Cy3的螢光硬度顯著低于ASCy3處理大鼠。但是，在CPR處理的大鼠肉瘤組織中幾乎沒有觀察到Cy3螢光。據悉，所有三種化合物都主要分布在胰腺和肝臟。給藥8小時后，APRCy3處理大鼠肉瘤組織中的Cy3螢光硬度仍低于ASCy3處理大鼠，而處理小鼠病變組織中未觀察到Cy3螢光。據悉，三組大鼠的腎臟、脾臟或腦部在兩個時間點均未測量到螢光訊號。為了進一步驗證ASPRO共軛物在MCF7異種移植物中是否具有肝病靶點能力，作者對在大鼠體內的分布進行了加成測試，并評估了其在體內的集聚情況（圖4b）。與在之前的實驗中，ASCy3和被選為對照組。有趣的是，能否辨識MCF7病變細胞并集聚在癌癥中，由于螢光在病變組織中的保留時間遠遠長于對照組中和ASCy3的保留時間。據悉，注射8小時后，癌癥中仍可觀察到強烈的螢光訊號，而處理過的大鼠肉瘤中則未觀察到螢光訊號。這種結果表明，APR在MCF7異種移植模型中表現出卓越的癌癥靶點能力。
作者在MCF7異種移植大鼠模型中評估了APR的體內抗肺癌效果。當癌癥植入后平均容積達到150立方毫米時，家兔被隨機分為六組。PBS或AS、CRO、PRO、CPR或DNA劑量為10mM的APR（PRO的劑量為10mgkg-1）隔日靜脈注射一次。如圖4c和d所示，PRO能有效抑制腫瘤生長，醫治21天后病變生長抑制率（TGI）達到59.8%。相比之下，CRO在體內沒有表現出抗肺癌活性。有趣的是，APR在體內表現出了卓越的抗肺癌功效，其TGI率為77.5%，這表明APR的效力顯著低于CPR（TGI=20.2%）和AS（TGI=28.8%）
據悉，還進一步評估了APR在異種移植大鼠模型中的毒性。在醫治期間，每3天檢測一次診治大鼠的體重（圖4e）。所有化合物在醫治組中的耐受性都挺好，體重沒有顯著增長，也沒有顯著的不良反應。接著，稱量了受試大鼠的主要臟器重量，以評估毒性（圖4f）。不同組間各臟器的重量無顯著差別。
與對照化合物相比，APR在誘導細胞自噬方面表現更好（圖4g）。APR組中Ki67染色細胞的數目顯著高于其他組，這意味著APR的TGI效果最好。為了進一步闡述體內BRD4的降解效率，使用抗BRD4抗原進行了免疫組化。如圖4h所示，與空白對照組相比，化合物CRO和AS只造成BRD4抒發發生輕微變化，而PRO和APR處理組的BRD4抒發則明顯升高。值得注意的是，APR比PRO更有效地減少了BRD4的抒發細胞膜選擇性通透，這表明AS修飾提高了大鼠體內BRD4的降解。
圖4.a、b)靜脈注射后ASCy3、和在主要臟器（H，腎臟；Li，腎臟；S細胞膜選擇性通透，卵巢；L，腎臟；K，心臟）和癌癥（T）中的體內分布；c)以每隔三天給藥一次的頻度進行靜脈注射醫治的21天期間癌癥容積的變化。紅色箭頭表示給藥時間點；d)不同組的異種移植肉瘤在接受所示醫治21天后的宏觀觀察結果。紅色箭頭表示給藥時間點；f)使用所示不同劑型進行靜脈注射醫治21天期間的癌癥和臟器重量剖析，給藥頻度為每隔三天一次；g)六個醫治組Ki67染色的病變組織切塊顯微相片；h)六個醫治組BRD4染色的病變組織切塊顯微相片（尺度條，200毫米)。
小結與討論
此項研究開發了一種用適配體修飾的新策略，以克服傳統的局限性。作者首次證明，聯接有助于提升癌癥靶點的特異性，因而提高體內抗肺癌活性和蛋白降解，增加毒性。因而，這項工作中構建的創新型APC技術具有改善傳統抗生素親和性的潛力。重要的是，因為適配體在精準醫療方面的優勢，這些適配體修飾策略可能會在靶點蛋白質降解方面有廣泛的應用。
作者今后的工作將旨在于探求多種適配體和設計新型聯接體，以提升癌癥組織的特異性和臨床效果。
原文鏈接
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撰稿|張嘉怡
排版|郝紅依
初審|陳正虎老師