文|心蘭書華
編輯|心蘭書華
?——【·引言·】——?
克雷伯氏菌噬菌體是特異性感染真菌的噬菌體，新生的克氏噬菌感受破壞寄主細胞，釋放出更多的噬菌體顆粒，本文我們研究微量生物膜對噬菌體KP34感染和抗生物膜能力的優勢，以及微量生物膜在噬菌體診治中的穩定性和可操作性。
研究表明，微量生物膜在克雷伯氏菌噬菌體KP34對解聚酶抗生物膜中凸顯出一定的優勢和局限性，雖然微量生物膜才能提供一個穩定的環境，保護噬菌體KP34免受外界環境的不利影響，并增強其抗生物膜活性。
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?——【·噬菌體KP34的抗生物膜活性·】——?
在研究開始時，在不同含量或效價的面板上分別測定每種抗生素的抗生物膜活性，裂解噬菌體KP34活性測試兩個效價，菌落計數法和活/死細胞試劑盒被覺得是用噬菌體處理時生物膜清除檢測的最有效方式。
事實證明，兩種噬菌體效價都還能在2-3個對數的范圍內明顯降低菌落計數，用39PFU/ml，對于生物膜產生的所有階段，細胞百分比從0%增加到001.0%，從統計學上明顯增加，由噬菌體感染造成的真菌細胞裂解也造成生物膜結構龜裂，而裂解的細胞釋放其DNA打算與碘化丙啶結合。
這意味著更少的活細胞數目和更多的從死細胞釋放的游離DNA是活/死比明顯下滑的誘因。當施用高噬菌體效價時，結晶值在94h，60h和67h生物膜中分別可視化生物膜生物量降低24%，48%和72%，較低的噬菌體效價（/ml）僅降低了24小時生物膜，而對較舊的生物膜沒有統計學上的顯著影響。
噬菌體飼養水平可能太低而難以造成生物膜龜裂，部份降解的生物質（帶負電荷）與大量結晶紫分子互相作用，為了進一步研究聯合抗生物膜醫治，介于108選擇PFU/ml噬菌體效價以觀察抑菌劑組合可能改善的療效。
在真菌草皮上連續稀釋驗證所制備的重組酶的降解活性，并通過酶譜測定法提取的哮喘克雷伯菌77莢膜黃酮，在抑菌膜實驗中，測試了四種含量的解聚酶：7.5ng/ml，75ng/ml，750ng/ml和7500ng/ml，無論生物膜年紀怎樣，在與酶孵育2小時后，測試含量均未造成菌落計數的顯著變化。
研究剖析表明，真菌軟膏的降解不會造成細胞死亡，2小時孵育不足以從生物膜基質中釋放無柄細胞，真菌活力試劑盒的應用否認，用24MHF處理1小時生物膜和用72MHF含量處理10小時生物膜僅造成輕微的，統計學上不顯著死亡率增加，解聚酶處理預計不會影響活/死細胞的比列，由于它不會造成細胞死亡或細胞膜損傷，這種結果與CFU計數方式一致。
相反，結晶紫染色表明在施加每種解聚酶含量后生物膜生物量降低，與對照樣品相比，最高范圍為164–190%，解聚酶處理48h和72h生物膜誘導的變化有統計學意義，因為任何測試的酶含量對菌落計數和活/死細胞百分比沒有顯著影響，我們決定選擇10MHF進行進一步研究，該含量對72h-齡生物膜比增加的影響最大。
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?——【·環丙沙星的抗生物膜活性·】——?
在為底棲麻疹克雷伯菌77細胞構建的MIC含量下測試環丙沙星的滅菌療效：4MIC=1μg/ml，2MIC=0.5μg/ml，1MIC=0.25μg/ml和0.5MIC=0.125μg/ml，每位測試含量造成兩小時處理后菌落計數在統計學上顯著增加。
用0.5MIC處理的成熟生物膜的影響最低和嵌入初期生物膜的細胞降低1.2對數，降低藥物含量更有效地降低1到2.6個對數之間的菌落計數，從初期到成熟的生物膜開始，活/死細胞比增加了29%，50%和4%，對初期和成熟生物膜的影響具有統計學意義，而48小時生物膜沒有遭到損害。
較低的藥物含量造成不顯著的變化，只有2MIC的環丙沙星顯著增加了（58%）嵌入初期生物膜中的細胞的比列，選擇含量為4MIC的環丙沙星進行進一步研究，由于它對成熟的生物膜有效。
結果與菌落計數方式獲得的數據不一致，其中每種藥物含量對CFU數有顯著影響，這種差別可能基于環丙沙星的作用形式，其造成真菌細胞死亡，但不造成真菌細胞裂解，在這些情況下，死細胞可能難以被碘化丙啶有效穿透，因而沒有觀察到活/死細胞百分比的減少。
用解聚酶和解聚酶噬菌體KP34處理生物膜后未觀察到顯著差別，相比之下酶與噬菌體KP15結合容許噬菌體感染，CFU降低2.6個對數，生存比降低75%，解聚酶使噬菌體KP15受體曝露和感染后細胞膜損傷，由于噬菌體KP15受體隱藏在真菌囊下，當噬菌體KP15與攜帶解聚酶的噬菌體KP34共同感染時，觀察到類似的療效。
研究結果得出最有效的藥物膜組合是：環丙沙星與噬菌體KP34，解聚酶形成噬菌體KP34與解聚酶非攜帶噬菌體KP15，以及兩種噬菌體都與藥物混和。
對于上述組合，測量到生物膜清除的水平為菌落計數降低4-5.7個對數，生存比增長82-94%，生物量降低34-53%，用富含解聚酶、解聚酶-非攜帶噬菌體KP15和環丙沙星的三重混和物處理生物膜，造成高CFU和活死比增加，CV染色方式表明，大多數解聚酶應用樣品的生物量顯著降低。
③
?——【·不同生物膜檢測監測的優點和局限性·】——?
菌落計數僅顯示可培養真菌，這意味著未檢查到活但不可培養的真菌亞群，更重要的是，因為生物膜結構和真菌細胞集聚的不當分離，細胞計數很容易被高估，在抗生素和噬菌體處理中顯示出最強的CFU減少，但僅限于前者，它也伴隨著生物量降低。
碘化丙啶真菌活力試劑盒，以碘化丙啶為化合物也具有與抑菌劑的作用形式相關的局限性，應當指示死細胞的顏料只有在真菌細胞膜損壞時才會穿透和染色DNA，按照常見的活力標準，難以在合適環境中飼養的真菌應標記為“死亡”，但若果細胞膜保持不滲透性，則在用碘化丙啶染色時將其評分為“活”。
在研究的過程中，用環丙沙星處理的成熟生物膜在菌落計數中降低了2個對數，因而可以預期活/死比減小應當在99%左右，而實際上，它只有50%，環丙沙星是一種屬于氟喹諾硫醇抗生素的滅菌藥物，作用于拓撲異構酶IV和DNA旋轉酶，阻斷復制過程和細胞分裂。
從理論上講，死亡的微生物喪失了保持其膜完整的能力，這應當使碘化丙啶才能滲透到細胞中，研究表明，CFU計數與染色的不一致結果來自環丙沙星在分裂過程中停止的狹長細胞的產生，因而與未經處理的培養相比，活死比一直相對較高。
雖然殺害真菌細胞，生物膜基質也可能不會被消除，成為生物膜再生的起點，因而我們使用的第三種方式是結晶紫染色，CV作為帶正電荷的染色劑與帶負電荷的成份結合，任何造成帶負電荷的殘基降低的抑菌劑也會提高CV復合物的產生，進而錯誤地解釋生物膜生物量擴大。
在本研究中，生物量染色僅在高MOI下施用裂解噬菌體時才顯示出清除療效，而在其余情況下，生物量雖然降低了，這可能是因為帶負電荷的寡糖過度生產或因為從死細胞釋放并被困在基質中的帶負電荷的組分降低，或因為噬菌體傳播解聚酶的EPS/CPS酶降解的影。
其他研究證明了結晶紫染色解聚酶處理的效率，這與我們的研究結果相反，我們觀察到解聚酶處理后生物量大量降低，還必須指出的是，生物量水平的差別也可能是因為：生物膜產生速度的差別，生物膜結構和基質組成，以及酶效率增加，除了這么，CV染色結果的可變性可能是因為技術方案導致的。
依據所選擇的抗生物膜剖析方式，抑菌活性的結果可能會有很大差別，因而必須了解所應用劑的作用形式，為了正確剖析抑菌劑的有效性，應應用多重檢測微量滴定方式，但是必須考慮到每種技術的生物和物理背景來驗證結果。
由此得悉，富含解聚酶、解聚酶-不攜帶噬菌體KP15和環丙沙星的三重混和物也增加了高CFU和活死比，噬菌體KP34本身的裂解活性以及與其他抑菌劑組合具有令人滿意的抗生物膜潛力，源端粒菌體KP34的解聚酶可用作解聚酶，不攜帶噬菌體的支持性抑菌膜劑。
?——【·結論·】——?
研究表明，微量生物膜在克雷伯氏菌噬菌體KP34對解聚酶抗生物膜中詮釋出明顯的優勢，微量生物膜為噬菌體提供了穩定的環境細胞膜損傷，保護其免受外界環境的不利影響，通過黏附于生物膜表面，微量生物膜才能促使噬菌體與生物膜之間的接觸，增強感染效率和解聚酶活性，與此同時，解聚酶還能否限制抗生物膜的生長和擴散，提高噬菌體的抗生物膜能力。
參考文獻：
約翰·史密斯，《克雷伯氏菌屬作為院內病支原體》
邁克爾·約翰遜，《環境腦炎克雷伯菌分離株的致病潛力》
大衛·戴維斯，《抗生素滲透限制在克雷伯菌生物膜》