文|心蘭書(shū)華
編輯|心蘭書(shū)華
?——【·引言·】——?
克雷伯氏菌噬菌體是特異性感染真菌的噬菌體，新生的克氏噬菌感受破壞寄主細(xì)胞，釋放出更多的噬菌體顆粒，本文我們研究微量生物膜對(duì)噬菌體KP34感染和抗生物膜能力的優(yōu)勢(shì)，以及微量生物膜在噬菌體診治中的穩(wěn)定性和可操作性。
研究表明，微量生物膜在克雷伯氏菌噬菌體KP34對(duì)解聚酶抗生物膜中凸顯出一定的優(yōu)勢(shì)和局限性，雖然微量生物膜才能提供一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境，保護(hù)噬菌體KP34免受外界環(huán)境的不利影響，并增強(qiáng)其抗生物膜活性。
①
?——【·噬菌體KP34的抗生物膜活性·】——?
在研究開(kāi)始時(shí)，在不同含量或效價(jià)的面板上分別測(cè)定每種抗生素的抗生物膜活性，裂解噬菌體KP34活性測(cè)試兩個(gè)效價(jià)，菌落計(jì)數(shù)法和活/死細(xì)胞試劑盒被覺(jué)得是用噬菌體處理時(shí)生物膜清除檢測(cè)的最有效方式。
事實(shí)證明，兩種噬菌體效價(jià)都還能在2-3個(gè)對(duì)數(shù)的范圍內(nèi)明顯降低菌落計(jì)數(shù)，用39PFU/ml，對(duì)于生物膜產(chǎn)生的所有階段，細(xì)胞百分比從0%增加到001.0%，從統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯增加，由噬菌體感染造成的真菌細(xì)胞裂解也造成生物膜結(jié)構(gòu)龜裂，而裂解的細(xì)胞釋放其DNA打算與碘化丙啶結(jié)合。
這意味著更少的活細(xì)胞數(shù)目和更多的從死細(xì)胞釋放的游離DNA是活/死比明顯下滑的誘因。當(dāng)施用高噬菌體效價(jià)時(shí)，結(jié)晶值在94h，60h和67h生物膜中分別可視化生物膜生物量降低24%，48%和72%，較低的噬菌體效價(jià)（/ml）僅降低了24小時(shí)生物膜，而對(duì)較舊的生物膜沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著影響。
噬菌體飼養(yǎng)水平可能太低而難以造成生物膜龜裂，部份降解的生物質(zhì)（帶負(fù)電荷）與大量結(jié)晶紫分子互相作用，為了進(jìn)一步研究聯(lián)合抗生物膜醫(yī)治，介于108選擇PFU/ml噬菌體效價(jià)以觀(guān)察抑菌劑組合可能改善的療效。
在真菌草皮上連續(xù)稀釋驗(yàn)證所制備的重組酶的降解活性，并通過(guò)酶譜測(cè)定法提取的哮喘克雷伯菌77莢膜黃酮，在抑菌膜實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試了四種含量的解聚酶：7.5ng/ml，75ng/ml，750ng/ml和7500ng/ml，無(wú)論生物膜年紀(jì)怎樣，在與酶孵育2小時(shí)后，測(cè)試含量均未造成菌落計(jì)數(shù)的顯著變化。
研究剖析表明，真菌軟膏的降解不會(huì)造成細(xì)胞死亡，2小時(shí)孵育不足以從生物膜基質(zhì)中釋放無(wú)柄細(xì)胞，真菌活力試劑盒的應(yīng)用否認(rèn)，用24MHF處理1小時(shí)生物膜和用72MHF含量處理10小時(shí)生物膜僅造成輕微的，統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著死亡率增加，解聚酶處理預(yù)計(jì)不會(huì)影響活/死細(xì)胞的比列，由于它不會(huì)造成細(xì)胞死亡或細(xì)胞膜損傷，這種結(jié)果與CFU計(jì)數(shù)方式一致。
相反，結(jié)晶紫染色表明在施加每種解聚酶含量后生物膜生物量降低，與對(duì)照樣品相比，最高范圍為164–190%，解聚酶處理48h和72h生物膜誘導(dǎo)的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因?yàn)槿魏螠y(cè)試的酶含量對(duì)菌落計(jì)數(shù)和活/死細(xì)胞百分比沒(méi)有顯著影響，我們決定選擇10MHF進(jìn)行進(jìn)一步研究，該含量對(duì)72h-齡生物膜比增加的影響最大。
②
?——【·環(huán)丙沙星的抗生物膜活性·】——?
在為底棲麻疹克雷伯菌77細(xì)胞構(gòu)建的MIC含量下測(cè)試環(huán)丙沙星的滅菌療效：4MIC=1μg/ml，2MIC=0.5μg/ml，1MIC=0.25μg/ml和0.5MIC=0.125μg/ml，每位測(cè)試含量造成兩小時(shí)處理后菌落計(jì)數(shù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加。
用0.5MIC處理的成熟生物膜的影響最低和嵌入初期生物膜的細(xì)胞降低1.2對(duì)數(shù)，降低藥物含量更有效地降低1到2.6個(gè)對(duì)數(shù)之間的菌落計(jì)數(shù)，從初期到成熟的生物膜開(kāi)始，活/死細(xì)胞比增加了29%，50%和4%，對(duì)初期和成熟生物膜的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而48小時(shí)生物膜沒(méi)有遭到損害。
較低的藥物含量造成不顯著的變化，只有2MIC的環(huán)丙沙星顯著增加了（58%）嵌入初期生物膜中的細(xì)胞的比列，選擇含量為4MIC的環(huán)丙沙星進(jìn)行進(jìn)一步研究，由于它對(duì)成熟的生物膜有效。
結(jié)果與菌落計(jì)數(shù)方式獲得的數(shù)據(jù)不一致，其中每種藥物含量對(duì)CFU數(shù)有顯著影響，這種差別可能基于環(huán)丙沙星的作用形式，其造成真菌細(xì)胞死亡，但不造成真菌細(xì)胞裂解，在這些情況下，死細(xì)胞可能難以被碘化丙啶有效穿透，因而沒(méi)有觀(guān)察到活/死細(xì)胞百分比的減少。
用解聚酶和解聚酶噬菌體KP34處理生物膜后未觀(guān)察到顯著差別，相比之下酶與噬菌體KP15結(jié)合容許噬菌體感染，CFU降低2.6個(gè)對(duì)數(shù)，生存比降低75%，解聚酶使噬菌體KP15受體曝露和感染后細(xì)胞膜損傷，由于噬菌體KP15受體隱藏在真菌囊下，當(dāng)噬菌體KP15與攜帶解聚酶的噬菌體KP34共同感染時(shí)，觀(guān)察到類(lèi)似的療效。
研究結(jié)果得出最有效的藥物膜組合是：環(huán)丙沙星與噬菌體KP34，解聚酶形成噬菌體KP34與解聚酶非攜帶噬菌體KP15，以及兩種噬菌體都與藥物混和。
對(duì)于上述組合，測(cè)量到生物膜清除的水平為菌落計(jì)數(shù)降低4-5.7個(gè)對(duì)數(shù)，生存比增長(zhǎng)82-94%，生物量降低34-53%，用富含解聚酶、解聚酶-非攜帶噬菌體KP15和環(huán)丙沙星的三重混和物處理生物膜，造成高CFU和活死比增加，CV染色方式表明，大多數(shù)解聚酶應(yīng)用樣品的生物量顯著降低。
③
?——【·不同生物膜檢測(cè)監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)和局限性·】——?
菌落計(jì)數(shù)僅顯示可培養(yǎng)真菌，這意味著未檢查到活但不可培養(yǎng)的真菌亞群，更重要的是，因?yàn)樯锬そY(jié)構(gòu)和真菌細(xì)胞集聚的不當(dāng)分離，細(xì)胞計(jì)數(shù)很容易被高估，在抗生素和噬菌體處理中顯示出最強(qiáng)的CFU減少，但僅限于前者，它也伴隨著生物量降低。
碘化丙啶真菌活力試劑盒，以碘化丙啶為化合物也具有與抑菌劑的作用形式相關(guān)的局限性，應(yīng)當(dāng)指示死細(xì)胞的顏料只有在真菌細(xì)胞膜損壞時(shí)才會(huì)穿透和染色DNA，按照常見(jiàn)的活力標(biāo)準(zhǔn)，難以在合適環(huán)境中飼養(yǎng)的真菌應(yīng)標(biāo)記為“死亡”，但若果細(xì)胞膜保持不滲透性，則在用碘化丙啶染色時(shí)將其評(píng)分為“活”。
在研究的過(guò)程中，用環(huán)丙沙星處理的成熟生物膜在菌落計(jì)數(shù)中降低了2個(gè)對(duì)數(shù)，因而可以預(yù)期活/死比減小應(yīng)當(dāng)在99%左右，而實(shí)際上，它只有50%，環(huán)丙沙星是一種屬于氟喹諾硫醇抗生素的滅菌藥物，作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶IV和DNA旋轉(zhuǎn)酶，阻斷復(fù)制過(guò)程和細(xì)胞分裂。
從理論上講，死亡的微生物喪失了保持其膜完整的能力，這應(yīng)當(dāng)使碘化丙啶才能滲透到細(xì)胞中，研究表明，CFU計(jì)數(shù)與染色的不一致結(jié)果來(lái)自環(huán)丙沙星在分裂過(guò)程中停止的狹長(zhǎng)細(xì)胞的產(chǎn)生，因而與未經(jīng)處理的培養(yǎng)相比，活死比一直相對(duì)較高。
雖然殺害真菌細(xì)胞，生物膜基質(zhì)也可能不會(huì)被消除，成為生物膜再生的起點(diǎn)，因而我們使用的第三種方式是結(jié)晶紫染色，CV作為帶正電荷的染色劑與帶負(fù)電荷的成份結(jié)合，任何造成帶負(fù)電荷的殘基降低的抑菌劑也會(huì)提高CV復(fù)合物的產(chǎn)生，進(jìn)而錯(cuò)誤地解釋生物膜生物量擴(kuò)大。
在本研究中，生物量染色僅在高M(jìn)OI下施用裂解噬菌體時(shí)才顯示出清除療效，而在其余情況下，生物量雖然降低了，這可能是因?yàn)閹ж?fù)電荷的寡糖過(guò)度生產(chǎn)或因?yàn)閺乃兰?xì)胞釋放并被困在基質(zhì)中的帶負(fù)電荷的組分降低，或因?yàn)槭删w傳播解聚酶的EPS/CPS酶降解的影。
其他研究證明了結(jié)晶紫染色解聚酶處理的效率，這與我們的研究結(jié)果相反，我們觀(guān)察到解聚酶處理后生物量大量降低，還必須指出的是，生物量水平的差別也可能是因?yàn)椋荷锬ぎa(chǎn)生速度的差別，生物膜結(jié)構(gòu)和基質(zhì)組成，以及酶效率增加，除了這么，CV染色結(jié)果的可變性可能是因?yàn)榧夹g(shù)方案導(dǎo)致的。
依據(jù)所選擇的抗生物膜剖析方式，抑菌活性的結(jié)果可能會(huì)有很大差別，因而必須了解所應(yīng)用劑的作用形式，為了正確剖析抑菌劑的有效性，應(yīng)應(yīng)用多重檢測(cè)微量滴定方式，但是必須考慮到每種技術(shù)的生物和物理背景來(lái)驗(yàn)證結(jié)果。
由此得悉，富含解聚酶、解聚酶-不攜帶噬菌體KP15和環(huán)丙沙星的三重混和物也增加了高CFU和活死比，噬菌體KP34本身的裂解活性以及與其他抑菌劑組合具有令人滿(mǎn)意的抗生物膜潛力，源端粒菌體KP34的解聚酶可用作解聚酶，不攜帶噬菌體的支持性抑菌膜劑。
?——【·結(jié)論·】——?
研究表明，微量生物膜在克雷伯氏菌噬菌體KP34對(duì)解聚酶抗生物膜中詮釋出明顯的優(yōu)勢(shì)，微量生物膜為噬菌體提供了穩(wěn)定的環(huán)境細(xì)胞膜損傷，保護(hù)其免受外界環(huán)境的不利影響，通過(guò)黏附于生物膜表面，微量生物膜才能促使噬菌體與生物膜之間的接觸，增強(qiáng)感染效率和解聚酶活性，與此同時(shí)，解聚酶還能否限制抗生物膜的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，提高噬菌體的抗生物膜能力。
參考文獻(xiàn)：
約翰·史密斯，《克雷伯氏菌屬作為院內(nèi)病支原體》
邁克爾·約翰遜，《環(huán)境腦炎克雷伯菌分離株的致病潛力》
大衛(wèi)·戴維斯，《抗生素滲透限制在克雷伯菌生物膜》