近些年來，將納米技術(shù)應用于防治和根治性疾病卡介苗的設(shè)計中取得了重大進展。但是，因為納米卡介苗的組成復雜，抗體呈遞細胞（APC）激活和抗體交叉呈遞的時空協(xié)調(diào)困難，納米卡介苗的臨床轉(zhuǎn)化一直遭到限制。開發(fā)具有天然刺激活性的卡介苗載體為進一步增強腫瘤納米卡介苗的效率和轉(zhuǎn)化潛力提供了一個有前景的方向，既可以簡化卡介苗的設(shè)計和生產(chǎn)流程，進而推動卡介苗系統(tǒng)投放市場的速率；又有望更好地協(xié)調(diào)抗體交叉呈遞和APCs激活，引起更強的免疫應答。
圖1：PEI-M的設(shè)計和作用機制示意圖
西安應用物理研究所宋萬通副研究員、陳學思教授團隊設(shè)計了一種極簡的二元納米卡介苗（BiVax），將天然刺激活性整合到載體中以引起強悍的抗肺癌免疫。首先制備了一系列唑類分子封端的聚乙烯吡啶(PEI-M)，超過60%的PEI-M聚合物通過激活干擾素基因剌激因子(STING)通路而具有天然的刺激活性。其中，PEI-4BImi，PEI-M庫中表現(xiàn)最好的聚合物之一，通過簡單地與卵清蛋白(OVA)抗體混和，可用作皮下注射的納米卡介苗引起強悍的抗肺癌免疫反應。通過將PEI-4BImi與自體病變細胞膜蛋白抗體復合，實現(xiàn)了個性化BiVax的快速制備，與免疫檢測點抑制劑聯(lián)合使用時，術(shù)后醫(yī)治率達到60%。這些BiVax系統(tǒng)的性能比傳統(tǒng)的“三元”疫苗系統(tǒng)以及商業(yè)化的含鋁佐劑要好得多，能用于個性化醫(yī)療，有望進行腫瘤卡介苗的臨床轉(zhuǎn)化。該研究以題為“Afor”發(fā)表在最新一期的《》上。
【PEI的設(shè)計與篩選】
對STING興奮劑的結(jié)構(gòu)剖析表明，對于與同型二聚體STING蛋白復合物的結(jié)合并在雜環(huán)結(jié)合口袋中產(chǎn)生構(gòu)象進行互相作用，含氮配體結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。用50μg/mL的PEI-M培養(yǎng)大鼠DC2.4細胞24小時后，通過測量培養(yǎng)液中IFN-β的含量來評價這種PEI-M聚合物在細胞中的固有剌激效應。在檢測的15個結(jié)構(gòu)中，其中6種PEI-M聚合物可誘導DC2.4細胞分泌400pg/mL以上的IFN-β，而無論是PEI還是這種小分子都不能在相同含量下誘導DC2.4細胞分泌可測量到的IFN-β。評估了PEI-M中唑分子共聚物次數(shù)對剌激療效的影響。PEI-4Imi的剌激療效隨著嵌段率的降低而降低，而PEI-5Thi和PEI-4BImi則以共聚物數(shù)40為最佳，當共聚物數(shù)降低到60時，剌激療效大幅上漲。這可能是因為PEI上修飾了過多的疏水側(cè)鏈，溶化性較差所致。
圖2：PEI-M庫的篩選
使用OVA蛋白作為模型抗體制備BiVax。通過簡單的混和，PEI-M與OVA蛋白形成靜電互相作用，很容易組裝成納米顆粒，水動力半徑約為50-100nm。在系列稀釋過程中，PEI-4Imi/OVA復合物可耐受52倍的稀釋直至解體，說明了其對稀釋的穩(wěn)定性。評估了皮下注射PEI基BiVax后，局部淋巴結(jié)(LNs)中APCs的成熟情況。與游離OVA相比，PEI-M負載降低了淋巴結(jié)內(nèi)抗體的積累。其中，PEI-4BImi其實是BiVax設(shè)計中表現(xiàn)最好的聚合物細胞膜蛋白，選擇了PEI-4Imi進行后續(xù)的體內(nèi)根治評價。
圖3：BiVax的制備及體內(nèi)鑒別
【BiVax的醫(yī)治療效】
評估了使用PEI-4BImi作為卡介苗載體設(shè)計的BiVax在B16-OVA黃色素瘤模型中的醫(yī)治療效。與其它組相比，PEI-4Imi/OVA對B16-OVA的抑制療效最好，第22天的癌癥抑制率為83.2%。PEI-4BImi/OVA處理的大鼠脾細胞在脈沖孵育OVA肽或蛋白時比其他組分泌更多的IFN-γ，這表明PEI-4BImi/OVA處理組誘導了更多的抗體特異性T細胞。剖析了不同配方的OVA卡介苗接種健康大鼠外周血的免疫反應。與其他醫(yī)治組相比，PEI-4BImi/OVA接種后的IFN-γ+、CD4+T細胞和IFN-γ+、CD8+T細胞的比列要高得多，否認PEI-4BImi/OVA接種提升了大鼠強烈的T細胞應答。PEI-4BImi/OVA免疫大鼠的抗體特異性裂解率達80%以上，遠低于其他各組，說明PEI-4BImi作為卡介苗載體能高效誘導抗體特異性免疫應答。
圖4：作為BiVax的PEI-4BImi/OVA體內(nèi)根治相關(guān)表征
【BiVax個性化卡介苗平臺】
構(gòu)建了大鼠的術(shù)后惡變的直腸癌癥模型，從摘除的癌癥中提取MC38癌癥細胞膜蛋白，獲得個性化的癌癥抗體(MAg)，并將PEI-4BImi與MAg簡單混和制備個性化的BiVax(4BImi/MAg)。與其他組相比，4BImi/MAgBiVax對術(shù)后胃癌惡變的抑制療效更好，術(shù)后第19天的癌癥抑制率為88.6%，醫(yī)治率為33%。當4BImi/MAgBiVax聯(lián)合免疫檢測點抑制劑aPD-L1抗原時，第19天觀察到癌癥抑制率為96.9%，60%的大鼠完全醫(yī)治；且醫(yī)治大鼠未見病變惡變細胞膜蛋白，提示BiVax診治后有效記憶作用的構(gòu)建。這種結(jié)果表明，基于PEI-4BImi的BiVax系統(tǒng)用于術(shù)后醫(yī)治的有效性和必要性。
圖5：基于PEI-4BImi的BiVax作為個性化卡介苗平臺
【小結(jié)】
綜上所述，作者提出了一種用于BiVax設(shè)計和術(shù)后腫瘤卡介苗醫(yī)治的極簡卡介苗載體。發(fā)覺了將一種五元環(huán)唑衍生物封端PEI（PEI-M）后，可以通過STING途徑有效剌激DC細胞分泌IFN，而且只需將PEI-M與蛋白質(zhì)抗體混和即可制備BiVax。這種類型的BiVax優(yōu)于傳統(tǒng)的三元納米卡介苗和商用鋁基卡介苗。據(jù)悉，該BiVax平臺就能快速制備用于術(shù)后腫瘤診治的個性化卡介苗，當BiVax與aPD-L1聯(lián)合用于術(shù)后MC38癌癥醫(yī)治時，60%的大鼠完全醫(yī)治。該基于PEI-M的BiVax平臺具有巨大的臨床轉(zhuǎn)化潛力。