螢光迸發(fā)和發(fā)射的基本原理
螢光顏料是光敏化合物，還能吸收特定波長的光能，并轉(zhuǎn)化為波長更長的光。為此，螢光顏料是細(xì)胞和組織研究中常用的測量試劑。螢光顏料特有的電子構(gòu)象讓其具有奇特的特點(diǎn)性吸收波譜（常與迸發(fā)類似）和發(fā)射波譜。這種吸收和發(fā)射波譜顯示了螢光的相對(duì)硬度，一般縱座標(biāo)為相對(duì)硬度，橫座標(biāo)為波長。對(duì)于已知的螢光顏料，制造協(xié)會(huì)告知光源迸發(fā)硬度峰值的波長，以及螢光發(fā)射硬度峰值的波長。對(duì)于這種螢光顏料的迸發(fā)和發(fā)射波譜圖與曲線來說，了解其來源很重要。
怎樣確定螢光顏料的發(fā)射波譜
確定特定螢光顏料的發(fā)射波譜時(shí)，須要確定最大吸收波長（常等同于最大迸發(fā)波長）并在該波長下迸發(fā)該螢光顏料。圖1(a)中顯示了一個(gè)典型螢光顏料的吸收波譜，縱座標(biāo)為吸收的相對(duì)硬度，橫座標(biāo)為波長。之后，我們用一個(gè)單色器（一種僅容許窄光波段通過的裝置）進(jìn)行掃描，得到全范圍發(fā)射波長下相對(duì)應(yīng)的螢光發(fā)射硬度值。圖1(b)中顯示了基于各波長下螢光相對(duì)硬度的檢測值勾畫的發(fā)射波譜。確定特定螢光顏料的迸發(fā)波譜時(shí)，也采用了類似的方式，即在用一組連續(xù)的波長迸發(fā)螢光官能團(tuán)的同時(shí)，檢測不同波長下的最大螢光發(fā)射硬度。確定最大螢光發(fā)射硬度，并只容許最大螢光發(fā)射硬度對(duì)應(yīng)波長的發(fā)射光通過測量器。在各迸發(fā)波長下（一般通過單色器）誘導(dǎo)迸發(fā)，并檢測作為波長函數(shù)的發(fā)射螢光硬度。檢測結(jié)果可勾畫為如圖1(a)所示的圖形或曲線，描畫了全范圍迸發(fā)波長波譜相對(duì)應(yīng)的螢光硬度。
螢光濾光片波譜
探求螢光迸發(fā)、發(fā)射和二色濾光片波譜圖的重疊區(qū)域，以及各類濾光片組合使透射特點(diǎn)發(fā)生變化，這些變化是怎樣決定波長的帶寬。
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迸發(fā)和發(fā)射波譜的觀察結(jié)果
一組典型的迸發(fā)和發(fā)射曲線或波譜可讓我們得到多個(gè)觀察結(jié)果。迸發(fā)波譜的短波長端和發(fā)射波譜的長波長端之間一般會(huì)有一個(gè)重疊區(qū)域。在螢光顯微鏡中，迸發(fā)和發(fā)射硬度與波長的重疊區(qū)域（如圖1(c)所示）必須通過選擇適當(dāng)?shù)谋虐l(fā)濾光片、分光鏡（反射光螢光）和發(fā)射濾光片來去除。否則，迸發(fā)光太亮?xí)诓剌^弱的螢光發(fā)射光，因而明顯減少標(biāo)本的對(duì)比度。
斯托克斯定理
當(dāng)電子從迸發(fā)態(tài)步入能級(jí)時(shí)，會(huì)有振動(dòng)能損失（這一現(xiàn)象的解釋見“熒光的分子機(jī)理”）。由于波長與幅射能成正比(
)，能量損失使發(fā)射波譜較相應(yīng)的迸發(fā)波譜更長。這些現(xiàn)象被稱為斯托克斯定理(’Law)或斯托克斯位移，由G.爵士在十九世紀(jì)中期發(fā)覺。斯托克斯位移越大，就越容易分離迸發(fā)光和發(fā)射光。為了獲得最高的螢光硬度，最好在螢光顏料迸發(fā)波長的峰值處進(jìn)行迸發(fā)，在發(fā)射波長的峰值處（或由觀察者選擇的其他波長下）進(jìn)行測量。迸發(fā)波長和發(fā)射波長的選擇由合適的濾光片控制，因而可限制準(zhǔn)許通過的波長。在確定整個(gè)光學(xué)系統(tǒng)的波譜療效時(shí)，要求進(jìn)行額外的技術(shù)校準(zhǔn)，須要考慮例如玻璃的透射率和檢查器的靈敏度對(duì)應(yīng)不同波長的差別等誘因。
圖2顯示了一個(gè)典型螢光顏料的吸收-發(fā)射波譜圖。請(qǐng)注意，這一典型螢光顏料的吸收（常與純化合物的迸發(fā)曲線相像）和發(fā)射螢光硬度曲線在形狀上有些相像。據(jù)悉，在迸發(fā)曲線的短波長端和發(fā)射曲線的長波長端有部份重疊。
螢光濾光片組
探求迸發(fā)和吸收濾光片的帶通波長區(qū)域的改變是怎樣僅讓特定的波段照射樣本，并隨即通過測量器，同時(shí)排除其他波長。
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迸發(fā)和發(fā)射波長的分離
迸發(fā)和發(fā)射波長的分離可通過選擇適當(dāng)?shù)臑V光片制止或放行波譜中的特定波長而實(shí)現(xiàn)，如圖3所示。螢光照陶俑的設(shè)計(jì)是基于對(duì)迸發(fā)光和發(fā)射光的控制，即在通向樣本的（迸發(fā)）光路和樣本所形成的（發(fā)射）光路中插入可隨時(shí)更換的濾光片。考慮到發(fā)射硬度低的情況，選擇的迸發(fā)光源必須有足夠的照度，這樣就能最大限度地測量到相對(duì)較弱的發(fā)射光，同時(shí)選擇的螢光顏料須要具備合適的吸收和發(fā)射效率。
螢光顏料吸收迸發(fā)光的效率稱為分子消光系數(shù)。分子消光系數(shù)越大，給定波長范圍內(nèi)光吸收的可能性就越大（誘發(fā)螢光發(fā)射的前提條件之一）。發(fā)射光的豐度稱為量子豐度，即發(fā)射的量子數(shù)（能量“包”）與吸收的量子數(shù)之比（許多商用螢光顏料的豐度在0.1和0.9之間）。量子豐度高于1是能量通過非幅射路徑（如熱或則光物理反應(yīng)），而不是通過螢光的再幅射路徑損失能量的結(jié)果。表1中給出了一組特定螢光顏料的螢光量子豐度。請(qǐng)注意，有些螢光顏料的量子豐度雖然很低（苯），而其他則很高（螢光素和羅丹明-B）。
螢光顏料的螢光量子豐度表1化合物溶劑迸發(fā)
波長
(nm)發(fā)射
波長
(nm)量子豐度
吖啶橙
乙酸
493
535
0.46
苯
乙酸
248
300-350
0.04
葉綠素A
乙酸
440
685
0.23
伊紅
水
521
544
0.16
螢光素
水
437
515
0.92
羅丹明-B
乙酸
555
627
0.97
光源的分子消光系數(shù)、量子豐度和平均發(fā)光硬度（固有照度）以及螢光壽命（迸發(fā)態(tài)的持續(xù)時(shí)間）都是影響螢光發(fā)射硬度和可用性的重要誘因。據(jù)悉，螢光顏料周圍的局部環(huán)境是決定螢光發(fā)射特點(diǎn)的關(guān)鍵誘因。環(huán)境中的溶劑黏度、離子含量、pH值和疏水性等變量，對(duì)螢光硬度和迸發(fā)態(tài)的壽命都有著重要影響。
螢光的分子機(jī)理
另一種勾勒螢光活性的方式是雅布隆斯基()圖葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象的原理，如圖4(a)所示。迸發(fā)前，分子的電子構(gòu)象一般處于能級(jí)下。吸收了迸發(fā)光的一個(gè)光子后葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象的原理，電子可能在短短的幾皮秒（10-15秒）內(nèi)獲得更高的能量躍遷到震動(dòng)迸發(fā)態(tài)。
在大概萬億分之1秒（飛秒或10-12秒）內(nèi)，迸發(fā)態(tài)電子可能會(huì)向周圍環(huán)境中釋放部份振動(dòng)能，并返回到最低迸發(fā)單重態(tài)。隨即，電子可從最低迸發(fā)單重態(tài)“弛豫”回到能級(jí)，同時(shí)發(fā)射螢光，如圖4(a)所示。發(fā)射光的波長仍然比迸發(fā)光波長長（斯托克斯定理），但是只要迸發(fā)光仍然照射螢光標(biāo)本，發(fā)射光都會(huì)持續(xù)存在。假如迸發(fā)光停止，發(fā)射螢光也會(huì)消失。
雅布隆斯基能量圖
借助雅布隆斯基基態(tài)圖探求電子是怎樣吸收能量并躍遷到更高的能量狀態(tài)。電子處于迸發(fā)態(tài)時(shí)，都會(huì)在震動(dòng)效應(yīng)下平緩弛豫，之后通過發(fā)射光子（螢光）后回到能級(jí)。
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有時(shí)，迸發(fā)后的電子不會(huì)在震動(dòng)效應(yīng)下弛豫到最低的單重態(tài)，而是向迸發(fā)三重態(tài)進(jìn)行躍遷，之后再回到能級(jí)，在這個(gè)過程中，幅射的發(fā)射現(xiàn)象可顯著延后幾秒或更多時(shí)間。這一現(xiàn)象是磷光的特點(diǎn)，如圖4(b)所示。在個(gè)別情況下，迸發(fā)后的電子可能會(huì)從三重態(tài)回到最低的迸發(fā)單重態(tài)，之后再回到能級(jí)，此后發(fā)射螢光。這一作用的時(shí)間比一般的螢光略長（約一兩毫秒），稱為延后螢光（圖4(c)）。在光漂白或存在重金屬鹽或其他物理物質(zhì)等其他情況下，發(fā)射光可顯著減少甚至完全消失。
退色或光漂白
有些特定條件可影響受迸發(fā)的螢光官能團(tuán)的再幅射，進(jìn)而造成螢光硬度增長。這些減少發(fā)射光硬度的現(xiàn)象一般稱為退色或光漂白。有時(shí)會(huì)將退色進(jìn)一步細(xì)分為淬滅和漂白。漂白是螢光分子在分子氧存在下因?yàn)楣鈴?qiáng)而發(fā)生的不可逆分解。淬滅也會(huì)造成螢光硬度增加，且常由氧化劑的作用或存在重金屬鹽或鹵素化合物而引起。
一般，淬滅是因?yàn)槟芰繌谋虐l(fā)態(tài)螢光絡(luò)合物轉(zhuǎn)移到數(shù)學(xué)上接近的其他受體分子而產(chǎn)生的，亦稱為共振能量轉(zhuǎn)移。這些特殊的現(xiàn)象早已成為一種更新技術(shù)的基礎(chǔ)，這些技術(shù)用于檢測遠(yuǎn)高于光學(xué)顯微鏡縱向碼率的距離。
漂白的發(fā)生造成了FRAP技術(shù)的產(chǎn)生，即螢光漂白后恢復(fù)技術(shù)。FRAP技術(shù)借助短脈沖激光漂白，因而可觀察隨即因螢光官能團(tuán)擴(kuò)散到漂白區(qū)域中而導(dǎo)致的螢光恢復(fù)現(xiàn)象。
常用抗淬滅試劑的特點(diǎn)表2防退色劑注釋
對(duì)苯二胺
對(duì)FITC最有效試劑。也對(duì)羅丹明有效。使用甘油/PBS進(jìn)行配制，含量為0.1%。此試劑在光照下會(huì)變黑，應(yīng)儲(chǔ)存于暗處。接觸皮膚時(shí)非常危險(xiǎn)。
三乙烯二胺
（1,4-二氮雜三環(huán)-2,2,2-辛烷）
對(duì)FITC高度有效。與對(duì)苯二胺相比，療效略低，但其更耐水，且安全水平更高。
沒食子酸正丁醇
對(duì)羅丹明和FITC都有療效。使用甘油/PBS進(jìn)行配制，含量為0.1%。
2-甲基嗎啉
用于觀察碘化丙啶、吖啶橙或色霉素A3染色的染色體和DNA樣本。應(yīng)在Tris-EDTA中調(diào)節(jié)至0.1mM2-甲基嗎啉的純度。
為了增加部份樣本的退色程度，建議在光抵達(dá)迸發(fā)濾光片之前的光路中使用一個(gè)中性灰度濾光片，可以減少迸發(fā)光的硬度。在其他情況下，可改變封丸劑的pH值或使用抗漂白劑（表2中列舉了幾種較為重要的試劑）可減少退色效應(yīng)。在數(shù)字成像、顯微成像或簡單目視觀察時(shí)，快速改變觀察視野也可防止掉色效應(yīng)。