螢光迸發和發射的基本原理
螢光顏料是光敏化合物，還能吸收特定波長的光能，并轉化為波長更長的光。為此，螢光顏料是細胞和組織研究中常用的測量試劑。螢光顏料特有的電子構象讓其具有奇特的特點性吸收波譜（常與迸發類似）和發射波譜。這種吸收和發射波譜顯示了螢光的相對硬度，一般縱座標為相對硬度，橫座標為波長。對于已知的螢光顏料，制造協會告知光源迸發硬度峰值的波長，以及螢光發射硬度峰值的波長。對于這種螢光顏料的迸發和發射波譜圖與曲線來說，了解其來源很重要。
怎樣確定螢光顏料的發射波譜
確定特定螢光顏料的發射波譜時，須要確定最大吸收波長（常等同于最大迸發波長）并在該波長下迸發該螢光顏料。圖1(a)中顯示了一個典型螢光顏料的吸收波譜，縱座標為吸收的相對硬度，橫座標為波長。之后，我們用一個單色器（一種僅容許窄光波段通過的裝置）進行掃描，得到全范圍發射波長下相對應的螢光發射硬度值。圖1(b)中顯示了基于各波長下螢光相對硬度的檢測值勾畫的發射波譜。確定特定螢光顏料的迸發波譜時，也采用了類似的方式，即在用一組連續的波長迸發螢光官能團的同時，檢測不同波長下的最大螢光發射硬度。確定最大螢光發射硬度，并只容許最大螢光發射硬度對應波長的發射光通過測量器。在各迸發波長下（一般通過單色器）誘導迸發，并檢測作為波長函數的發射螢光硬度。檢測結果可勾畫為如圖1(a)所示的圖形或曲線，描畫了全范圍迸發波長波譜相對應的螢光硬度。
螢光濾光片波譜
探求螢光迸發、發射和二色濾光片波譜圖的重疊區域，以及各類濾光片組合使透射特點發生變化，這些變化是怎樣決定波長的帶寬。
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迸發和發射波譜的觀察結果
一組典型的迸發和發射曲線或波譜可讓我們得到多個觀察結果。迸發波譜的短波長端和發射波譜的長波長端之間一般會有一個重疊區域。在螢光顯微鏡中，迸發和發射硬度與波長的重疊區域（如圖1(c)所示）必須通過選擇適當的迸發濾光片、分光鏡（反射光螢光）和發射濾光片來去除。否則，迸發光太亮會掩藏較弱的螢光發射光，因而明顯減少標本的對比度。
斯托克斯定理
當電子從迸發態步入能級時，會有振動能損失（這一現象的解釋見“熒光的分子機理”）。由于波長與幅射能成正比(
)，能量損失使發射波譜較相應的迸發波譜更長。這些現象被稱為斯托克斯定理(’Law)或斯托克斯位移，由G.爵士在十九世紀中期發覺。斯托克斯位移越大，就越容易分離迸發光和發射光。為了獲得最高的螢光硬度，最好在螢光顏料迸發波長的峰值處進行迸發，在發射波長的峰值處（或由觀察者選擇的其他波長下）進行測量。迸發波長和發射波長的選擇由合適的濾光片控制，因而可限制準許通過的波長。在確定整個光學系統的波譜療效時，要求進行額外的技術校準，須要考慮例如玻璃的透射率和檢查器的靈敏度對應不同波長的差別等誘因。
圖2顯示了一個典型螢光顏料的吸收-發射波譜圖。請注意，這一典型螢光顏料的吸收（常與純化合物的迸發曲線相像）和發射螢光硬度曲線在形狀上有些相像。據悉，在迸發曲線的短波長端和發射曲線的長波長端有部份重疊。
螢光濾光片組
探求迸發和吸收濾光片的帶通波長區域的改變是怎樣僅讓特定的波段照射樣本，并隨即通過測量器，同時排除其他波長。
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迸發和發射波長的分離
迸發和發射波長的分離可通過選擇適當的濾光片制止或放行波譜中的特定波長而實現，如圖3所示。螢光照陶俑的設計是基于對迸發光和發射光的控制，即在通向樣本的（迸發）光路和樣本所形成的（發射）光路中插入可隨時更換的濾光片。考慮到發射硬度低的情況，選擇的迸發光源必須有足夠的照度，這樣就能最大限度地測量到相對較弱的發射光，同時選擇的螢光顏料須要具備合適的吸收和發射效率。
螢光顏料吸收迸發光的效率稱為分子消光系數。分子消光系數越大，給定波長范圍內光吸收的可能性就越大（誘發螢光發射的前提條件之一）。發射光的豐度稱為量子豐度，即發射的量子數（能量“包”）與吸收的量子數之比（許多商用螢光顏料的豐度在0.1和0.9之間）。量子豐度高于1是能量通過非幅射路徑（如熱或則光物理反應），而不是通過螢光的再幅射路徑損失能量的結果。表1中給出了一組特定螢光顏料的螢光量子豐度。請注意，有些螢光顏料的量子豐度雖然很低（苯），而其他則很高（螢光素和羅丹明-B）。
螢光顏料的螢光量子豐度表1化合物溶劑迸發
波長
(nm)發射
波長
(nm)量子豐度
吖啶橙
乙酸
493
535
0.46
苯
乙酸
248
300-350
0.04
葉綠素A
乙酸
440
685
0.23
伊紅
水
521
544
0.16
螢光素
水
437
515
0.92
羅丹明-B
乙酸
555
627
0.97
光源的分子消光系數、量子豐度和平均發光硬度（固有照度）以及螢光壽命（迸發態的持續時間）都是影響螢光發射硬度和可用性的重要誘因。據悉，螢光顏料周圍的局部環境是決定螢光發射特點的關鍵誘因。環境中的溶劑黏度、離子含量、pH值和疏水性等變量，對螢光硬度和迸發態的壽命都有著重要影響。
螢光的分子機理
另一種勾勒螢光活性的方式是雅布隆斯基()圖葉綠素熒光現象的原理，如圖4(a)所示。迸發前，分子的電子構象一般處于能級下。吸收了迸發光的一個光子后葉綠素熒光現象的原理，電子可能在短短的幾皮秒（10-15秒）內獲得更高的能量躍遷到震動迸發態。
在大概萬億分之1秒（飛秒或10-12秒）內，迸發態電子可能會向周圍環境中釋放部份振動能，并返回到最低迸發單重態。隨即，電子可從最低迸發單重態“弛豫”回到能級，同時發射螢光，如圖4(a)所示。發射光的波長仍然比迸發光波長長（斯托克斯定理），但是只要迸發光仍然照射螢光標本，發射光都會持續存在。假如迸發光停止，發射螢光也會消失。
雅布隆斯基能量圖
借助雅布隆斯基基態圖探求電子是怎樣吸收能量并躍遷到更高的能量狀態。電子處于迸發態時，都會在震動效應下平緩弛豫，之后通過發射光子（螢光）后回到能級。
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有時，迸發后的電子不會在震動效應下弛豫到最低的單重態，而是向迸發三重態進行躍遷，之后再回到能級，在這個過程中，幅射的發射現象可顯著延后幾秒或更多時間。這一現象是磷光的特點，如圖4(b)所示。在個別情況下，迸發后的電子可能會從三重態回到最低的迸發單重態，之后再回到能級，此后發射螢光。這一作用的時間比一般的螢光略長（約一兩毫秒），稱為延后螢光（圖4(c)）。在光漂白或存在重金屬鹽或其他物理物質等其他情況下，發射光可顯著減少甚至完全消失。
退色或光漂白
有些特定條件可影響受迸發的螢光官能團的再幅射，進而造成螢光硬度增長。這些減少發射光硬度的現象一般稱為退色或光漂白。有時會將退色進一步細分為淬滅和漂白。漂白是螢光分子在分子氧存在下因為光強而發生的不可逆分解。淬滅也會造成螢光硬度增加，且常由氧化劑的作用或存在重金屬鹽或鹵素化合物而引起。
一般，淬滅是因為能量從迸發態螢光絡合物轉移到數學上接近的其他受體分子而產生的，亦稱為共振能量轉移。這些特殊的現象早已成為一種更新技術的基礎，這些技術用于檢測遠高于光學顯微鏡縱向碼率的距離。
漂白的發生造成了FRAP技術的產生，即螢光漂白后恢復技術。FRAP技術借助短脈沖激光漂白，因而可觀察隨即因螢光官能團擴散到漂白區域中而導致的螢光恢復現象。
常用抗淬滅試劑的特點表2防退色劑注釋
對苯二胺
對FITC最有效試劑。也對羅丹明有效。使用甘油/PBS進行配制，含量為0.1%。此試劑在光照下會變黑，應儲存于暗處。接觸皮膚時非常危險。
三乙烯二胺
（1,4-二氮雜三環-2,2,2-辛烷）
對FITC高度有效。與對苯二胺相比，療效略低，但其更耐水，且安全水平更高。
沒食子酸正丁醇
對羅丹明和FITC都有療效。使用甘油/PBS進行配制，含量為0.1%。
2-甲基嗎啉
用于觀察碘化丙啶、吖啶橙或色霉素A3染色的染色體和DNA樣本。應在Tris-EDTA中調節至0.1mM2-甲基嗎啉的純度。
為了增加部份樣本的退色程度，建議在光抵達迸發濾光片之前的光路中使用一個中性灰度濾光片，可以減少迸發光的硬度。在其他情況下，可改變封丸劑的pH值或使用抗漂白劑（表2中列舉了幾種較為重要的試劑）可減少退色效應。在數字成像、顯微成像或簡單目視觀察時，快速改變觀察視野也可防止掉色效應。