背景：
結合自由能估算在許多研究中發揮著重要作用，但估算過程冗長易錯，讓人望而興嘆。許多步驟須要人為干預，缺少標準，別人無法復現。BFEE2軟件在嚴謹的理論基礎上對絕對結合自由能估算進行了標準化和手動化，盡量降低人的干預，使估算結果確切、可復現。南開學院的蔡文生、邵學廣課題組與美國國家科研中心的課題組合作，實現了手動、流水線化、具有用戶友好操作界面的蛋白質-絡合物標準結合自由能估算軟件BFEE2[1]，近來在上發文詳盡介紹了蛋白質-官能團結合自由能估算的操作流程[2]。
BFEE2僅須要蛋白質-官能團結合復合體就可以進行自由能估算，除了提供GUI便捷使用，也提供CLI便捷批量估算，兼具易用性和專業性，使更廣大的用戶群體可以進行更可靠確切的絕對結合自由能估算。不管是煉金術（）路線還是幾何（）路線,確切的絕對自由能估算都分包含多個步驟,且須要引入幾何約束。但是人為干預，例如定義CVs（）、準備輸入文件、監控模擬過程、后處理，除了沉悶、麻煩，但是容易出錯。為了實現手動化和流程化（）的自由能估算，非常是面向非專業用戶結合能，第二代結合自由能評估器（free，BFEE2）提供了標準化的煉金術和幾何自由能估算流程，除去人為干預以保證估算結果的完全可重復。為了最大化覆蓋蛋白質-絡合物復合體，或則更廣泛的主體-客體復合體，BFEE2支持絕大多數學術力場，如、Amber、OPLS、?？梢陨蒒AMD和格式的配置文件，且所有的后處理都可以手動化。最后，自由能估算是否收斂可以通過模擬過程中生成的中間文件判別?？偠灾?strong>結合能，BFEE2是一個簡單易用、功能強悍的確切自由能估算工具，可以幫助用戶實現廣泛的應用。
軟件：BFEE2中實現了兩種蛋白質-官能團結合自由能估算的操作流程，分別為基于幾何路徑（）和基于“煉金術”（）的流程。
free(BFEE)isa-basedthatfreetheorrouteby.
NAMD(androute)and(route，基于幾何路徑)as;
3.6+,2,numpy,and.
.詳盡見：([]編譯-進行自由能估算)
簡單了解
基于幾何路徑的流程通過重要性取樣方式，逐漸研究蛋白質-官能團的結合-解離過程中不同自由度對結合自由能的貢獻，其中每步聚焦于1個自由度（圖1a）；基于“煉金術”的流程，采用自由能微擾或熱力學積分方式，完成圖1b所示的熱力學循環中每位步驟的自由能估算，并匯總得到結合自由能。
圖1.基于幾何路徑（a）和基于“煉金術”（b）的流程示意圖。（a）中的字母和“RMSD”分別代表不同的自由度，（b）中的鎖代表幾何約束。
圖2顯示了采用BFEE2進行結合自由能估算的詳盡流程。
首先須要選擇使用的流程，通常而言，基于幾何路徑的流程收斂速率會較快，尤其是卟啉分子較大時?？墒腔趲缀温窂降牧鞒讨贿m用于官能團在蛋白質表面或僅被半包埋的情形，而基于“煉金術”的流程可以適用于幾乎全部情形。
BFEE2會手動生成進行自由能估算所需的全部輸入文件，用戶僅須要采用分子動力學軟件進行自由能估算和確認估算的收斂性。而后，BFEE2會手動進行后處理，給出結合自由能的數值。
圖2.采用BFEE2進行結合自由能估算的流程。
圖3給出了BFEE2界面的示意圖。
各選項的具體含意、軟件的詳盡使用方式、示例和預期結果在原文[2]中均有詳盡介紹。
據悉，正文中還以實際體系為例，介紹了采用BFEE2進行結合自由能估算過程中可能碰到的困難，并針對性地給出了解決方案。
所需的示例文件在可以在原文的補充信息中下載。
圖3.BFEE2軟件的主界面。該界面截屏于10系統，BFEE2同樣支持MacOS和主流Linux系統。
軟件安裝
BFEE2軟件以GPLV3授權的方式開源發布，軟件的源代碼可以在下載。軟件的二補碼包可以在pip和conda平臺中獲?。╬ipbfee2或conda-cconda-forgebfee2）。
深入文獻
標準化手動化的CV定義
自由能估算時，CVs（又稱反應座標、廣義座標）的選擇是十分重要的一步，作者選用科學嚴謹七自由度CVs，見圖1A。以蛋白質-絡合物復合體為輸入，定義7個自由度分別為用球座標（r，θ，φ）表示官能團的平移變化，蛋白質以固定朝向置于球坐標的中心。其中r為蛋白質剛體到官能團剛體的距離。以結合狀態的官能團為參考，估算歐拉角（Θ，Φ，Ψ）和RMSD，表示官能團的旋轉變化和氫鍵變化。因為歐拉角有萬向鎖問題，官能團的旋轉會先轉化為四元數，再轉化為歐拉角。因為七自由度CVs可以按照復合體手動生成，這使標準化和手動化地打算所有輸入文件成為可能。
定義蛋白質-官能團的CVs（A）煉金術絕對自由能估算流程（B）
亮點總結
雖然早已有不少自由能估算輔助軟件，如基于的YANK（煉金術路線）、基于網頁的-GUI（煉金術路線）、BFEE1.0（幾何路線），BFEE2應當是第一個將煉金術路線和幾何路線的絕對結合自由能估算統一到一個框架中的軟件，通過標準化，從而手動化，這除了增強了自由能估算的可用性，也提升了估算結果的可復現性，更便捷不同方法比較，推動自由能估算方式的發展。
參考文獻：
[1]Fu,H.H.;Chen,H.C.;Cai,W.S.;fú,X.G.;and,C.BFEE2:,,andFree-.J.Chem.Inf.Model.2021,61,2116–2123.
[2]Fu,H.H.;Chen,H.C.;,M;DeLacam,E.G.C.;,F.;,A;fú,X.G.;,J.C.;Dehez,F.;Roux,B.;Cai,W.S.;,C.of:freefrom.Nat..2022,doi:10.1038/-021-00676-1.