通信作者：鄭浩院士（中國海洋學院），邢松江院長（英國麻省學院）
通信單位：中國海洋學院，英國麻省學院
論文DOI：10.1021/.
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圖片摘要
成果簡介
日前，中國海洋學院鄭浩院長課題組與日本麻省學院阿默斯特學校邢松江院士在ACSAu上發表了題為“ofacidsonof--genesgenus”的研究論文（DOI：10.1021/.），并成功入圍第3卷第2期封面文章。本研究針對多功能底泥改良劑木醋液（acids，PA）縮減底泥ARGs污染過程中怎樣影響抗性基因水平轉移（HGT）這一關鍵科學問題，否認了PA對RP4引物介導的多重耐藥基因在大腸球菌HB101和之間的接合轉移具有效應（即低劑量推動但高劑量抑制），闡明了高劑量的PA因為其抗菌性抑制了RP4引物接合轉移的發生，而低劑量的PA通過誘導細胞內活性氧的形成、促進細胞膜私密性及降低細胞間接觸，促使了RP4引物的接合轉移。研究結果為基于PA的底泥ARG污染阻控技術的完善提供了新的科學看法，同時指出了底泥改良劑施用不當時推動ARGs傳播擴散的潛在風險。
序言
藥物濫用引起的真菌耐藥性已成為21世紀恐嚇人類健康和生態環境安全的重大挑戰。糞肥施用、污水灌溉、污泥澆水和垃圾填埋等人類活動造成大量的藥物抗性基因（genes，ARGs）步入底泥，致使農業底泥成為ARGs的重要存儲庫。富集于底泥中的ARGs可通過食物鏈步入人體，進一步激化藥物耐藥性對人類健康的恐嚇。因而，有效縮減底泥ARGs污染對減輕藥物耐藥性在全球范圍內傳播并保障全球生態系統健康具有重要意義。生物質熱解產物木醋液（acids，PA）作為一種多功能底泥改良劑，可增加底泥鹽分和pH，調節真菌群落，滅活動物病原菌，促使小麥生長并提升糧食產值。課題組前期研究發覺，無論是PA單獨施用，還是與生物炭聯合施用，均可通過抑制基因水平轉移（HGT）、降低重金屬共選擇壓力、調節微生物群落等途徑有效減少底泥ARGs產率，且PA對HGT的抑制是ARGs降低的主要誘因。但是，PA對HGT過程的影響機制尚不明晰，限制了基于PA的底泥ARG污染修補技術的發展。本研究以攜帶RP4抗性引物的大腸球菌HB101為供體菌、大腸球菌為受體菌建立接合轉移模型，以廢棄木材為原料于450°C下熱解制備木醋液面膜（PA）為代表，借助平板計數法評估了PA對RP4引物介導的ARGs在大腸球菌種內接合轉移影響的劑量效應關系（圖1）。為進一步明晰PA的關鍵成份及pH對PA影響ARGs接合轉移的作用，選擇98、130和220°C下PA的三種分餾組分（F1、F2和F3）以及磷酸、2-甲氧基乙醇、2,6-二甲氧基酚和3-氨基-1,2-環戊二酮四種關鍵代表性成份，并通過調節接合體系的pH，探究了其對ARGs接合轉移的影響（圖1）。最后，通過探究真菌活性、ROS形成、細胞膜透性、表面形貌、胞外聚合物（EPS）分泌及表面電荷變化，闡明了PA調控ARGs接合轉移的分子機制（圖1）。本研究將為基于PA的底泥ARG污染阻控技術的完善提供新的科學看法。
圖1.本研究實驗設計示意圖
圖文導讀
PA對RP4引物在大腸球菌間的接合轉移具有效應
（a）接合子數目；（b）接合轉移頻度；（c）受體菌數目；（d）供體菌數目
圖2.不同劑量的木醋液PA對RP4引物在大腸球菌間接合轉移的影響
為評估PA對RP4引物介導的ARGs接合轉移的劑量效應關系，借助平板計數法測定了接合子數目和接合轉移頻度（圖2）。與對照組相比，較高劑量的PA（40~100μL）使接合子數目明顯減少了74~85%（圖2a），抑制了RP4引物的接合轉移。但是，60~100μL的劑量下接合轉移頻度卻較空白對照明顯增強了30~45%（圖2b）。這主要歸因于PA造成受體真菌數目降低（86~90%）的程度小于接合子（78~85%）(圖2a，c)。但是，較低劑量（10和20μL）的PA使接合子數目和接合轉移頻度明顯降低了26~47%和114~234%（圖2a，b），顯著推動了RP4引物的接合轉移。這種結果否認了PA對ARGs在真菌種屬內的接合轉移具有效應，即低劑量推動但高劑量抑制。
PA的關鍵組分對接合轉移的影響
（a）接合子數目；（b）接合轉移頻度；（c）受體菌數目；（d）供體菌數目
圖3.PA及其一種分餾組分對RP4引物在大腸球菌間接合轉移的影響
為明晰PA的物理組分對PA影響RP4引物接合轉移的作用，首先探究了PA的三種分餾組分（F1、F2和F3）對ARGs接合轉移的影響（圖3）。與PA相像，三種分餾組分對RP4引物接合轉移也表現出了類似的效應（圖3a，b）。尤其是較高劑量的F3（40μL）使接合子數目降低了49%，而較低劑量（10和20μL）下接合子數目降低了25~63%。另外，PA及其組分對接合轉移作用的效應程度PA>F3≈F2>F1（圖3）。這種結果與課題組前期的研究結果一致，即PA及其分餾組分有效減少了底泥中ARGs的產率，這進一步否認了PA通過抑制HGT過程來縮減底泥ARGs污染的可行性。
（a,b）磷酸；（c,d）磷酸、2-甲氧基乙醇；（e,f）2,6-二甲氧基酚；（g,h）3-氨基-1,2-環戊二酮
圖4.PA的四種關鍵成份對接合子數目和RP4引物在大腸球菌間接合轉移頻度的影響
PA及分餾組分具有不同濃度的酸類、酚類和硫醇等物理物質，這可能造成其對接合轉移的影響程度不同。為進一步明晰PA中影響ARGs接合轉移的具體組分，按照其物理組成，探究了磷酸、2-甲氧基酚、2,6-二甲氧基乙烷和3-氨基-1,2-環戊二酮四種具有抑菌和抗氧化性能的代表性組分對RP4接合轉移的影響（圖4）。與PA及其一種分餾組分相像，和對照組相比，PA的四種關鍵成份在亞抑制含量下（即丙酮和2-甲氧基苯胺含量為0.001mg/mL，2,6-二甲氧基乙烷含量為0.1mg/mL，3-羥基-1,2-環戊二酮為0.05mg/mL）分別使接合子數目降低了39%、49%、12%和24%（圖4），促使程度為磷酸≈2-甲氧基酚>2,6-二甲氧基乙烷≈3-羥基-1,2-環戊二酮。相反地，當這四種物質的含量低于MIC時（即丙酮含量為0.1mg/mL，2-甲氧基苯胺含量為1mg/mL，2,6-二甲氧基乙烷含量為2mg/mL，3-羥基-1,2-環戊二酮為3mg/mL），接合子數目均明顯降低，且增加程度為磷酸≈2,6-二甲氧基乙烷>3-羥基-1,2-環戊二酮>2-甲氧基乙醇（圖4）?？梢?，PA的這四種關鍵成份對RP4引物接合轉移也具有與PA相像的效應，這就否認了PA中的酸類、酚類和鹽類等化合物是其造成ARGs接合轉移劑量效應的關鍵誘因。
堿性PA增加了接合體系的pH因而抑制了RP4引物在大腸球菌間的接合轉移
（a，b）高劑量PA曝露下的接合子數目和接合轉移頻度；（c，d）低劑量PA曝露下的接合子數目和接合轉移頻度
圖5.PA堿性對RP4引物在大腸球菌間接合轉移的影響
ARGs接合轉移過程對外界環境條件（如pH、溫度、濕度和酸度等）非常敏感。PA中的磷酸和2-甲氧基乙醇等堿性成份使PA的pH常常呈堿性（≤2.81），這造成PA添加下的接合體系呈堿性（pH5.45~6.75）。為探究PA的pH對RP4引物接合轉移的影響，本研究進一步設置了空白組（CK，不添加PA且不調節pH）、pH對照組（pH，添加PA且不調節pH）、pH調節組（，添加PA且將接合體系pH調為7.0）與無PA處理組（noPA，不添加PA并將接合體系pH調節為與添加PA時一致），進行了同樣的接合轉移實驗。結果表明，添加較高劑量（40μL）的PA或分餾組分時，與pH對照組（pH5.45~6.45）相比，pH調節組的接合子數目和接合轉移頻度明顯降低；與空白組相比，無PA組（pH5.45~6.45）的接合子數目和接合轉移頻度分別增長了30~52%和12~39%（圖5a，b)。這說明高劑量的堿性PA增加了接合體系的pH值，繼而抑制了RP4引物的接合轉移。另外，添加較低劑量（20μL）的PA或分餾組分時，無PA組（pH6.07~6.75）的接合子數目和接合轉移頻度與空白組相比，分別增加了32~66%和10~67%（圖5c，d），這說明低劑量的PA增加了接合體系的pH，也是抑制ARGs接合轉移的主要誘因。綜上所述，這種結果證明了無論高劑量或低劑量的堿性PA所造成的接合體系pH的增加，均抑制了RP4引物在大腸球菌間的接合轉移。
值得注意的是，雖然pH調節組的與空白組的pH均為7.0，但高劑量PA下pH調節組的接合子數目仍高于空白組（圖5a，b），低劑量PA下pH調節組的接合子數目仍低于空白組（圖5c，d）。據悉，無PA組的pH值調節至與pH對照組相同后，高劑量下無PA組的接合子數目更高（圖5a細胞膜透性，b），低劑量下無PA組的接合子數目更低（圖5c，d）。這種結果進一步表明了不僅PA造成的接合體系pH增加外，PA的關鍵組分也是影響接合的重要誘因。往年研究發覺多種有毒有機化合物（如麥草畏、對羥基丙酮和乙酸）在高于MIC水平下，可通過降低胞內ROS、細胞膜透性和細胞間的接觸推動ARGs接合轉移，而低于MIC水平的這種化合物則可通過抗菌作用抑制ARGs的接合轉移。為此，我們推論同樣具有抗菌作用且富含大量酚類的PA對RP4引物的接合轉移也可能有相像作用機制，這種機制將在下邊進一步討論。
PA推動了真菌胞內ROS形成、細胞膜透性和真菌間接觸
（a）ROS形成；（b）GSH添加對接合轉移的影響；（c）TEM圖象；（d）腐細胞膜透性；（e）PN/PS及真菌表面Zeta電位
圖6.PA及其分餾組分對真菌胞內ROS形成、細胞膜透性及真菌間接觸的影響
外界環境脅迫誘導真菌細胞形成的活性氧（?O2–、?OH和H2O2）可剌激氧化應激，破壞生物分子（如DNA、膜蛋白和脂類），激活SOS反應，甚至引起細胞死亡，因而影響ARGs接合轉移。PA及其分餾組分造成供受體大腸球菌胞內ROS水平呈劑量依賴性降低，且降低程度次序為PA>F3>F2>F1（圖6a），這與它們對接合轉移的推動或抑制作用基本一致（圖3a，b）。低劑量的PA及其組分通過推動胞內ROS的形成，誘導氧化應激和SOS應答細胞膜透性，促使了RP4引物在大腸球菌間的接合轉移。雖然PA及其組分在高劑量時比低劑量誘導的ROS水平更高（圖6a），但因為過低水平的ROS常常造成真菌細胞死亡（圖3c，d），因而抑制了RP4引物的接合轉移。為了進一步確定所觀察到的ROS降低是否與屬內接合轉移有關，探究了ROS清理劑蘆?。℅SH）的添加對接合轉移的影響。結果表明，相對于不添加GSH組，添加GSH組的接合轉移頻度與不添加PA的空白對照組相比無明顯差別（圖6b），否認了PA及其組分誘導的ROS形成是其推動接合轉移的關鍵誘因。
真菌細胞膜是制止胞外物理物質和基因自由步入細胞的重要屏障。ROS可與細胞膜上的不飽和脂肪酸發生反應，導致脂類二溴化，造成細胞膜私密性提高。通過TEM圖象觀察，未處理組大腸球菌胞結構正常，細胞膜完整，表面光滑，胞漿致密，細胞分散，化學接觸有限（圖6c）。但是，低劑量（10和20μL）PA處理組中，細胞細胞膜顯著損傷，造成膜孔形成，細胞邊界模糊，菌毛破裂，細胞與細胞之間的接觸提高（圖6c），這種現象均有利于ARGs接合的發生。借助流式細胞儀進一步定量了PA對大腸球菌細胞膜私密性的影響（圖6d），發覺細胞膜私密性隨PA及其分餾組分劑量的降低而降低，且促使程度為PA>F3>F2>F1（圖6d），與推動接合轉移的作用相一致（圖3a，b），否認了低劑量PA通過降低細胞膜透性促使了ARGs接合轉移。但是，高劑量PA使病菌細胞完全滅活，細胞膜完全斷裂，這也是TEM圖中細胞膜損傷更嚴重、細胞質萎縮或漏水的緣由，進一步表明了高劑量PA造成細胞膜嚴重損壞使病菌失活，因而抑制了ARGs接合轉移（圖6c）。
有效的細胞間接觸是ARGs接合轉移成功的關鍵。EPS主要由蛋白質、多糖、胞外DNA和固醇組成，其通過推動細胞間接觸在生物膜產生和真菌基因轉移中發揮重要作用。EPS的形成受ROS的訊號調節。PA及其組分一方面降低了EPS中蛋白質與黃酮（PN/PS）的比列，提高了細胞表面疏水性，另一方面增加了真菌表面負電荷，減小了真菌細胞間的靜電作用力，更有利于病菌間的接觸，為RP4引物的傳播提供了便利（圖6e）。據悉，相關剖析結果表明，真菌胞內ROS形成、細胞膜透性及EPS的形成均與PA的乙醇，2-甲氧基乙醇，2，6-二甲氧基乙烷和3-氨基-1，2-環戊二酮四種關鍵成份濃度呈正相關，進一步否認了PA中的酸類、酚類和硫醇等代表性的物理組分誘導的非致死脅迫效應是其推動ARGs接合轉移的主要誘因。
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小結
該工作首次評估了多功能底泥改良劑PA對真菌屬內引物介導的多重耐藥基因接合轉移的效應（低劑量推動但高劑量抑制），并從分子水平上明晰了PA調控ARGs接合轉移的機制。較高劑量（40~100μL）的PA抑制RP4引物在大腸鏈球菌屬內接合的主要誘因是：（1）受體和供體生長遭到抑制；（2）抗氧化系統的破壞；（3）細胞膜破損；（4）菌毛破裂（圖7）。這些抑制作用主要是因為PA的抑菌成份（磷酸、2-甲氧基乙醇、2,6-二甲氧基乙烷和3-氨基-1,2-環戊二酮）以及PA的堿性（pH≤2.81）共同造成。較低劑量（10~20μL）的PA促使接合的主要誘因包括：（1）胞內ROS生成降低；（2）細胞膜私密性提高；（3）EPS濃度降低；（4）真菌表面電荷降低（圖7）。這些推動作用主要歸因于PA的關鍵物理成份誘導的真菌非致死脅迫效應。該研究為基于PA的底泥ARG污染阻控技術的完善提供了新的科學看法，并為底泥改良劑PA的合理施用提供了著力證據。基于PA對ARGs接合轉移的效應，本研究結果指出了優化底泥改良劑施用劑量以通過抑制ARGs的水平轉移縮減底泥ARGs污染的必要性。據悉，PA低劑量下對ARGs接合轉移的推動作用也引起了人們對PA和其他具有抑菌活性的底泥改良劑（如腐殖酸和木制素）不當施用而通過提高水平基因轉移推動底泥中ARGs傳播擴散的環境風險的憂慮。
鑒于PA的代表性組分（如酸類、酚類和硫醇）對接合轉移具有關鍵作用，未來可通過選擇合適的原料和分餾工藝優化PA的抗菌性能，以提升PA對底泥ARGs污染的修補療效。據悉，我們發覺PA在低劑量下通過降低ROS的形成、細胞膜透性和EPS的生產促使了ARGs接合轉移，因而PA與一些抗氧化劑（如蘆丁和硫尿）或EPS清理劑（如金屬基納米材料和群感訊號分子抑制酶）聯用可能有助于克服PA施加量不當時引起的ARGs傳播風險。但是，本研究僅選用了一種木材廢棄物制備的PA，且借助實驗室純菌培養模型來探究其對大腸球菌種內真菌間ARGs接合轉移的影響，但PA的原料和多元化的制備工藝常常造成其組成和性質差別較大，其對ARGs的接合轉移或其他水平轉移過程（如轉化和轉導）的影響，尤其是實際底泥生態系統的微生物群落之間ARGs水平轉移的影響可能也存在較大差別，未來仍值得進一步探究。
該項研究得到了ofSanyaBayandCity()，Keyand()，China()，FundYoungof()項目的捐助。
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