通信作者：鄭浩院士（中國海洋學(xué)院），邢松江院長（英國麻省學(xué)院）
通信單位：中國海洋學(xué)院，英國麻省學(xué)院
論文DOI：10.1021/.
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圖片摘要
成果簡介
日前，中國海洋學(xué)院鄭浩院長課題組與日本麻省學(xué)院阿默斯特學(xué)校邢松江院士在ACSAu上發(fā)表了題為“ofacidsonof--genesgenus”的研究論文（DOI：10.1021/.），并成功入圍第3卷第2期封面文章。本研究針對多功能底泥改良劑木醋液（acids，PA）縮減底泥ARGs污染過程中怎樣影響抗性基因水平轉(zhuǎn)移（HGT）這一關(guān)鍵科學(xué)問題，否認(rèn)了PA對RP4引物介導(dǎo)的多重耐藥基因在大腸球菌HB101和之間的接合轉(zhuǎn)移具有效應(yīng)（即低劑量推動但高劑量抑制），闡明了高劑量的PA因?yàn)槠淇咕砸种屏薘P4引物接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生，而低劑量的PA通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的形成、促進(jìn)細(xì)胞膜私密性及降低細(xì)胞間接觸，促使了RP4引物的接合轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果為基于PA的底泥ARG污染阻控技術(shù)的完善提供了新的科學(xué)看法，同時(shí)指出了底泥改良劑施用不當(dāng)時(shí)推動ARGs傳播擴(kuò)散的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
序言
藥物濫用引起的真菌耐藥性已成為21世紀(jì)恐嚇人類健康和生態(tài)環(huán)境安全的重大挑戰(zhàn)。糞肥施用、污水灌溉、污泥澆水和垃圾填埋等人類活動造成大量的藥物抗性基因（genes，ARGs）步入底泥，致使農(nóng)業(yè)底泥成為ARGs的重要存儲庫。富集于底泥中的ARGs可通過食物鏈步入人體，進(jìn)一步激化藥物耐藥性對人類健康的恐嚇。因而，有效縮減底泥ARGs污染對減輕藥物耐藥性在全球范圍內(nèi)傳播并保障全球生態(tài)系統(tǒng)健康具有重要意義。生物質(zhì)熱解產(chǎn)物木醋液（acids，PA）作為一種多功能底泥改良劑，可增加底泥鹽分和pH，調(diào)節(jié)真菌群落，滅活動物病原菌，促使小麥生長并提升糧食產(chǎn)值。課題組前期研究發(fā)覺，無論是PA單獨(dú)施用，還是與生物炭聯(lián)合施用，均可通過抑制基因水平轉(zhuǎn)移（HGT）、降低重金屬共選擇壓力、調(diào)節(jié)微生物群落等途徑有效減少底泥ARGs產(chǎn)率，且PA對HGT的抑制是ARGs降低的主要誘因。但是，PA對HGT過程的影響機(jī)制尚不明晰，限制了基于PA的底泥ARG污染修補(bǔ)技術(shù)的發(fā)展。本研究以攜帶RP4抗性引物的大腸球菌HB101為供體菌、大腸球菌為受體菌建立接合轉(zhuǎn)移模型，以廢棄木材為原料于450°C下熱解制備木醋液面膜（PA）為代表，借助平板計(jì)數(shù)法評估了PA對RP4引物介導(dǎo)的ARGs在大腸球菌種內(nèi)接合轉(zhuǎn)移影響的劑量效應(yīng)關(guān)系（圖1）。為進(jìn)一步明晰PA的關(guān)鍵成份及pH對PA影響ARGs接合轉(zhuǎn)移的作用，選擇98、130和220°C下PA的三種分餾組分（F1、F2和F3）以及磷酸、2-甲氧基乙醇、2,6-二甲氧基酚和3-氨基-1,2-環(huán)戊二酮四種關(guān)鍵代表性成份，并通過調(diào)節(jié)接合體系的pH，探究了其對ARGs接合轉(zhuǎn)移的影響（圖1）。最后，通過探究真菌活性、ROS形成、細(xì)胞膜透性、表面形貌、胞外聚合物（EPS）分泌及表面電荷變化，闡明了PA調(diào)控ARGs接合轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制（圖1）。本研究將為基于PA的底泥ARG污染阻控技術(shù)的完善提供新的科學(xué)看法。
圖1.本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖
圖文導(dǎo)讀
PA對RP4引物在大腸球菌間的接合轉(zhuǎn)移具有效應(yīng)
（a）接合子數(shù)目；（b）接合轉(zhuǎn)移頻度；（c）受體菌數(shù)目；（d）供體菌數(shù)目
圖2.不同劑量的木醋液PA對RP4引物在大腸球菌間接合轉(zhuǎn)移的影響
為評估PA對RP4引物介導(dǎo)的ARGs接合轉(zhuǎn)移的劑量效應(yīng)關(guān)系，借助平板計(jì)數(shù)法測定了接合子數(shù)目和接合轉(zhuǎn)移頻度（圖2）。與對照組相比，較高劑量的PA（40~100μL）使接合子數(shù)目明顯減少了74~85%（圖2a），抑制了RP4引物的接合轉(zhuǎn)移。但是，60~100μL的劑量下接合轉(zhuǎn)移頻度卻較空白對照明顯增強(qiáng)了30~45%（圖2b）。這主要?dú)w因于PA造成受體真菌數(shù)目降低（86~90%）的程度小于接合子（78~85%）(圖2a，c)。但是，較低劑量（10和20μL）的PA使接合子數(shù)目和接合轉(zhuǎn)移頻度明顯降低了26~47%和114~234%（圖2a，b），顯著推動了RP4引物的接合轉(zhuǎn)移。這種結(jié)果否認(rèn)了PA對ARGs在真菌種屬內(nèi)的接合轉(zhuǎn)移具有效應(yīng)，即低劑量推動但高劑量抑制。
PA的關(guān)鍵組分對接合轉(zhuǎn)移的影響
（a）接合子數(shù)目；（b）接合轉(zhuǎn)移頻度；（c）受體菌數(shù)目；（d）供體菌數(shù)目
圖3.PA及其一種分餾組分對RP4引物在大腸球菌間接合轉(zhuǎn)移的影響
為明晰PA的物理組分對PA影響RP4引物接合轉(zhuǎn)移的作用，首先探究了PA的三種分餾組分（F1、F2和F3）對ARGs接合轉(zhuǎn)移的影響（圖3）。與PA相像，三種分餾組分對RP4引物接合轉(zhuǎn)移也表現(xiàn)出了類似的效應(yīng)（圖3a，b）。尤其是較高劑量的F3（40μL）使接合子數(shù)目降低了49%，而較低劑量（10和20μL）下接合子數(shù)目降低了25~63%。另外，PA及其組分對接合轉(zhuǎn)移作用的效應(yīng)程度PA>F3≈F2>F1（圖3）。這種結(jié)果與課題組前期的研究結(jié)果一致，即PA及其分餾組分有效減少了底泥中ARGs的產(chǎn)率，這進(jìn)一步否認(rèn)了PA通過抑制HGT過程來縮減底泥ARGs污染的可行性。
（a,b）磷酸；（c,d）磷酸、2-甲氧基乙醇；（e,f）2,6-二甲氧基酚；（g,h）3-氨基-1,2-環(huán)戊二酮
圖4.PA的四種關(guān)鍵成份對接合子數(shù)目和RP4引物在大腸球菌間接合轉(zhuǎn)移頻度的影響
PA及分餾組分具有不同濃度的酸類、酚類和硫醇等物理物質(zhì)，這可能造成其對接合轉(zhuǎn)移的影響程度不同。為進(jìn)一步明晰PA中影響ARGs接合轉(zhuǎn)移的具體組分，按照其物理組成，探究了磷酸、2-甲氧基酚、2,6-二甲氧基乙烷和3-氨基-1,2-環(huán)戊二酮四種具有抑菌和抗氧化性能的代表性組分對RP4接合轉(zhuǎn)移的影響（圖4）。與PA及其一種分餾組分相像，和對照組相比，PA的四種關(guān)鍵成份在亞抑制含量下（即丙酮和2-甲氧基苯胺含量為0.001mg/mL，2,6-二甲氧基乙烷含量為0.1mg/mL，3-羥基-1,2-環(huán)戊二酮為0.05mg/mL）分別使接合子數(shù)目降低了39%、49%、12%和24%（圖4），促使程度為磷酸≈2-甲氧基酚>2,6-二甲氧基乙烷≈3-羥基-1,2-環(huán)戊二酮。相反地，當(dāng)這四種物質(zhì)的含量低于MIC時(shí)（即丙酮含量為0.1mg/mL，2-甲氧基苯胺含量為1mg/mL，2,6-二甲氧基乙烷含量為2mg/mL，3-羥基-1,2-環(huán)戊二酮為3mg/mL），接合子數(shù)目均明顯降低，且增加程度為磷酸≈2,6-二甲氧基乙烷>3-羥基-1,2-環(huán)戊二酮>2-甲氧基乙醇（圖4）?？梢?，PA的這四種關(guān)鍵成份對RP4引物接合轉(zhuǎn)移也具有與PA相像的效應(yīng)，這就否認(rèn)了PA中的酸類、酚類和鹽類等化合物是其造成ARGs接合轉(zhuǎn)移劑量效應(yīng)的關(guān)鍵誘因。
堿性PA增加了接合體系的pH因而抑制了RP4引物在大腸球菌間的接合轉(zhuǎn)移
（a，b）高劑量PA曝露下的接合子數(shù)目和接合轉(zhuǎn)移頻度；（c，d）低劑量PA曝露下的接合子數(shù)目和接合轉(zhuǎn)移頻度
圖5.PA堿性對RP4引物在大腸球菌間接合轉(zhuǎn)移的影響
ARGs接合轉(zhuǎn)移過程對外界環(huán)境條件（如pH、溫度、濕度和酸度等）非常敏感。PA中的磷酸和2-甲氧基乙醇等堿性成份使PA的pH常常呈堿性（≤2.81），這造成PA添加下的接合體系呈堿性（pH5.45~6.75）。為探究PA的pH對RP4引物接合轉(zhuǎn)移的影響，本研究進(jìn)一步設(shè)置了空白組（CK，不添加PA且不調(diào)節(jié)pH）、pH對照組（pH，添加PA且不調(diào)節(jié)pH）、pH調(diào)節(jié)組（，添加PA且將接合體系pH調(diào)為7.0）與無PA處理組（noPA，不添加PA并將接合體系pH調(diào)節(jié)為與添加PA時(shí)一致），進(jìn)行了同樣的接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，添加較高劑量（40μL）的PA或分餾組分時(shí)，與pH對照組（pH5.45~6.45）相比，pH調(diào)節(jié)組的接合子數(shù)目和接合轉(zhuǎn)移頻度明顯降低；與空白組相比，無PA組（pH5.45~6.45）的接合子數(shù)目和接合轉(zhuǎn)移頻度分別增長了30~52%和12~39%（圖5a，b)。這說明高劑量的堿性PA增加了接合體系的pH值，繼而抑制了RP4引物的接合轉(zhuǎn)移。另外，添加較低劑量（20μL）的PA或分餾組分時(shí)，無PA組（pH6.07~6.75）的接合子數(shù)目和接合轉(zhuǎn)移頻度與空白組相比，分別增加了32~66%和10~67%（圖5c，d），這說明低劑量的PA增加了接合體系的pH，也是抑制ARGs接合轉(zhuǎn)移的主要誘因。綜上所述，這種結(jié)果證明了無論高劑量或低劑量的堿性PA所造成的接合體系pH的增加，均抑制了RP4引物在大腸球菌間的接合轉(zhuǎn)移。
值得注意的是，雖然pH調(diào)節(jié)組的與空白組的pH均為7.0，但高劑量PA下pH調(diào)節(jié)組的接合子數(shù)目仍高于空白組（圖5a，b），低劑量PA下pH調(diào)節(jié)組的接合子數(shù)目仍低于空白組（圖5c，d）。據(jù)悉，無PA組的pH值調(diào)節(jié)至與pH對照組相同后，高劑量下無PA組的接合子數(shù)目更高（圖5a細(xì)胞膜透性，b），低劑量下無PA組的接合子數(shù)目更低（圖5c，d）。這種結(jié)果進(jìn)一步表明了不僅PA造成的接合體系pH增加外，PA的關(guān)鍵組分也是影響接合的重要誘因。往年研究發(fā)覺多種有毒有機(jī)化合物（如麥草畏、對羥基丙酮和乙酸）在高于MIC水平下，可通過降低胞內(nèi)ROS、細(xì)胞膜透性和細(xì)胞間的接觸推動ARGs接合轉(zhuǎn)移，而低于MIC水平的這種化合物則可通過抗菌作用抑制ARGs的接合轉(zhuǎn)移。為此，我們推論同樣具有抗菌作用且富含大量酚類的PA對RP4引物的接合轉(zhuǎn)移也可能有相像作用機(jī)制，這種機(jī)制將在下邊進(jìn)一步討論。
PA推動了真菌胞內(nèi)ROS形成、細(xì)胞膜透性和真菌間接觸
（a）ROS形成；（b）GSH添加對接合轉(zhuǎn)移的影響；（c）TEM圖象；（d）腐細(xì)胞膜透性；（e）PN/PS及真菌表面Zeta電位
圖6.PA及其分餾組分對真菌胞內(nèi)ROS形成、細(xì)胞膜透性及真菌間接觸的影響
外界環(huán)境脅迫誘導(dǎo)真菌細(xì)胞形成的活性氧（?O2–、?OH和H2O2）可剌激氧化應(yīng)激，破壞生物分子（如DNA、膜蛋白和脂類），激活SOS反應(yīng)，甚至引起細(xì)胞死亡，因而影響ARGs接合轉(zhuǎn)移。PA及其分餾組分造成供受體大腸球菌胞內(nèi)ROS水平呈劑量依賴性降低，且降低程度次序?yàn)镻A>F3>F2>F1（圖6a），這與它們對接合轉(zhuǎn)移的推動或抑制作用基本一致（圖3a，b）。低劑量的PA及其組分通過推動胞內(nèi)ROS的形成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和SOS應(yīng)答細(xì)胞膜透性，促使了RP4引物在大腸球菌間的接合轉(zhuǎn)移。雖然PA及其組分在高劑量時(shí)比低劑量誘導(dǎo)的ROS水平更高（圖6a），但因?yàn)檫^低水平的ROS常常造成真菌細(xì)胞死亡（圖3c，d），因而抑制了RP4引物的接合轉(zhuǎn)移。為了進(jìn)一步確定所觀察到的ROS降低是否與屬內(nèi)接合轉(zhuǎn)移有關(guān)，探究了ROS清理劑蘆?。℅SH）的添加對接合轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果表明，相對于不添加GSH組，添加GSH組的接合轉(zhuǎn)移頻度與不添加PA的空白對照組相比無明顯差別（圖6b），否認(rèn)了PA及其組分誘導(dǎo)的ROS形成是其推動接合轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵誘因。
真菌細(xì)胞膜是制止胞外物理物質(zhì)和基因自由步入細(xì)胞的重要屏障。ROS可與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致脂類二溴化，造成細(xì)胞膜私密性提高。通過TEM圖象觀察，未處理組大腸球菌胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞膜完整，表面光滑，胞漿致密，細(xì)胞分散，化學(xué)接觸有限（圖6c）。但是，低劑量（10和20μL）PA處理組中，細(xì)胞細(xì)胞膜顯著損傷，造成膜孔形成，細(xì)胞邊界模糊，菌毛破裂，細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸提高（圖6c），這種現(xiàn)象均有利于ARGs接合的發(fā)生。借助流式細(xì)胞儀進(jìn)一步定量了PA對大腸球菌細(xì)胞膜私密性的影響（圖6d），發(fā)覺細(xì)胞膜私密性隨PA及其分餾組分劑量的降低而降低，且促使程度為PA>F3>F2>F1（圖6d），與推動接合轉(zhuǎn)移的作用相一致（圖3a，b），否認(rèn)了低劑量PA通過降低細(xì)胞膜透性促使了ARGs接合轉(zhuǎn)移。但是，高劑量PA使病菌細(xì)胞完全滅活，細(xì)胞膜完全斷裂，這也是TEM圖中細(xì)胞膜損傷更嚴(yán)重、細(xì)胞質(zhì)萎縮或漏水的緣由，進(jìn)一步表明了高劑量PA造成細(xì)胞膜嚴(yán)重?fù)p壞使病菌失活，因而抑制了ARGs接合轉(zhuǎn)移（圖6c）。
有效的細(xì)胞間接觸是ARGs接合轉(zhuǎn)移成功的關(guān)鍵。EPS主要由蛋白質(zhì)、多糖、胞外DNA和固醇組成，其通過推動細(xì)胞間接觸在生物膜產(chǎn)生和真菌基因轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。EPS的形成受ROS的訊號調(diào)節(jié)。PA及其組分一方面降低了EPS中蛋白質(zhì)與黃酮（PN/PS）的比列，提高了細(xì)胞表面疏水性，另一方面增加了真菌表面負(fù)電荷，減小了真菌細(xì)胞間的靜電作用力，更有利于病菌間的接觸，為RP4引物的傳播提供了便利（圖6e）。據(jù)悉，相關(guān)剖析結(jié)果表明，真菌胞內(nèi)ROS形成、細(xì)胞膜透性及EPS的形成均與PA的乙醇，2-甲氧基乙醇，2，6-二甲氧基乙烷和3-氨基-1，2-環(huán)戊二酮四種關(guān)鍵成份濃度呈正相關(guān)，進(jìn)一步否認(rèn)了PA中的酸類、酚類和硫醇等代表性的物理組分誘導(dǎo)的非致死脅迫效應(yīng)是其推動ARGs接合轉(zhuǎn)移的主要誘因。
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小結(jié)
該工作首次評估了多功能底泥改良劑PA對真菌屬內(nèi)引物介導(dǎo)的多重耐藥基因接合轉(zhuǎn)移的效應(yīng)（低劑量推動但高劑量抑制），并從分子水平上明晰了PA調(diào)控ARGs接合轉(zhuǎn)移的機(jī)制。較高劑量（40~100μL）的PA抑制RP4引物在大腸鏈球菌屬內(nèi)接合的主要誘因是：（1）受體和供體生長遭到抑制；（2）抗氧化系統(tǒng)的破壞；（3）細(xì)胞膜破損；（4）菌毛破裂（圖7）。這些抑制作用主要是因?yàn)镻A的抑菌成份（磷酸、2-甲氧基乙醇、2,6-二甲氧基乙烷和3-氨基-1,2-環(huán)戊二酮）以及PA的堿性（pH≤2.81）共同造成。較低劑量（10~20μL）的PA促使接合的主要誘因包括：（1）胞內(nèi)ROS生成降低；（2）細(xì)胞膜私密性提高；（3）EPS濃度降低；（4）真菌表面電荷降低（圖7）。這些推動作用主要?dú)w因于PA的關(guān)鍵物理成份誘導(dǎo)的真菌非致死脅迫效應(yīng)。該研究為基于PA的底泥ARG污染阻控技術(shù)的完善提供了新的科學(xué)看法，并為底泥改良劑PA的合理施用提供了著力證據(jù)?；赑A對ARGs接合轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，本研究結(jié)果指出了優(yōu)化底泥改良劑施用劑量以通過抑制ARGs的水平轉(zhuǎn)移縮減底泥ARGs污染的必要性。據(jù)悉，PA低劑量下對ARGs接合轉(zhuǎn)移的推動作用也引起了人們對PA和其他具有抑菌活性的底泥改良劑（如腐殖酸和木制素）不當(dāng)施用而通過提高水平基因轉(zhuǎn)移推動底泥中ARGs傳播擴(kuò)散的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的憂慮。
鑒于PA的代表性組分（如酸類、酚類和硫醇）對接合轉(zhuǎn)移具有關(guān)鍵作用，未來可通過選擇合適的原料和分餾工藝優(yōu)化PA的抗菌性能，以提升PA對底泥ARGs污染的修補(bǔ)療效。據(jù)悉，我們發(fā)覺PA在低劑量下通過降低ROS的形成、細(xì)胞膜透性和EPS的生產(chǎn)促使了ARGs接合轉(zhuǎn)移，因而PA與一些抗氧化劑（如蘆丁和硫尿）或EPS清理劑（如金屬基納米材料和群感訊號分子抑制酶）聯(lián)用可能有助于克服PA施加量不當(dāng)時(shí)引起的ARGs傳播風(fēng)險(xiǎn)。但是，本研究僅選用了一種木材廢棄物制備的PA，且借助實(shí)驗(yàn)室純菌培養(yǎng)模型來探究其對大腸球菌種內(nèi)真菌間ARGs接合轉(zhuǎn)移的影響，但PA的原料和多元化的制備工藝常常造成其組成和性質(zhì)差別較大，其對ARGs的接合轉(zhuǎn)移或其他水平轉(zhuǎn)移過程（如轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)）的影響，尤其是實(shí)際底泥生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落之間ARGs水平轉(zhuǎn)移的影響可能也存在較大差別，未來仍值得進(jìn)一步探究。
該項(xiàng)研究得到了ofSanyaBayandCity()，Keyand()，China()，F(xiàn)undYoungof()項(xiàng)目的捐助。
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