本發明屬于細胞膜聯通號剖析技術領域，具體涉及一種微囊泡誘導細胞膜電位變化的無損檢查方式。
背景技術：
生物膜中脂類排列成雙分子層，在膜中每位類脂分子均可縱向運動，也可以發生轉動和聯接的活動，致使生物膜具有柔硬度、流動性、高內阻性以及對高分子的不透過性。固醇包括乙酸甘油酯(即磷脂)、鞘脂質和甾體，這種成份的有序排列及互相作用，產生了細胞膜特定的結構與生物功能。脂類均由一疏水部份和極性端基構成，磷脂或乙酸酯的極性端基間常能產生構象，大多數脂類的疏水部份為兩個脂肪族雙鏈。生物膜表面帶電主要誘因是組成生物膜的磷脂或生物大分子)帶有帶電側鏈（如氨基酸鏈的甲基末端和羥基末端）；導致生物膜內兩側的電荷不致具有一定的電位。
膜電位對細胞的生長、增殖以及酶活性等至關重要，造成細胞生長和分化異常、細胞功能衰弱。一些具有帶電性的蛋白質甚至dna鏈也會在膜上的特定微區-“脂筏”。脂筏組裝體是鞘磷脂緊密有序的排列，鞘磷脂所含長鏈飽和脂肪鏈，相變氣溫差，脂肪鏈流動性差，造成混和膜發生相分離。以脂單層分子的疏水端為界細胞膜電位，生物膜可分為近胞質面和非胞質面內外兩層，使生物膜具有不對稱性。同時膜脂、膜蛋白和復合糖在膜上均呈不對稱分布，造成膜具有不對稱性和方向性，進而使膜內外兩層的流動性不同，使物質傳遞有一定方向，訊號的接受和傳遞也有一定的方向性。
生物親脂性的顏料分子在膜的取向，顯示膜周圍的化學和物理性質。偶極是一個內部潛在生物膜膜脂類和水份子的界面的因為非隨機生成和電偶極的取向。按照細胞膜的成份不同，偶極在為200-范圍中，偶極可能影響膜蛋白和氨基酸等na+/k+和離子通道。
細胞膜內外具有不同的電位，常用膜邊鑷來測定細胞膜的電極電位，此方式對顯微觀察設備、實驗操作精確度要求比較高，主要采用探針尖端刺入被測細胞中，同時容易對細胞導致損傷。探針di-8-穩定螢光發光官能團坐落膜表面距離中心近200um,電荷轉移螢光波譜變化與螢光探針di-8-電場硬度相關，通過外加電場的改變來調控細胞膜的膜電位響應情況，結合雙波長螢光百分比估算方式，用螢光探針標記細胞膜測定膜電位的變化細胞膜電位，借助電場造成di-8-改變螢光硬度。
技術實現要素：
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種微囊泡誘導細胞膜電位變化的無損測量的技術方案。該方式通過采用膜電位敏感螢光探針di-8-標記細胞膜，采用微囊泡誘導細胞膜電位變化，通過螢光硬度的強弱反映了細胞膜電位的變化，且不影響細胞壽命。
所述的一種微囊泡誘導細胞膜電位變化的無損檢查方式，其特點在于包括以下步驟：
（1）以di-8-為螢光顏料標記細胞膜；
（2）通過脈沖發生器調節電場變化，使細胞螢光硬度與外加電場成線性相關；
（3）通過微囊泡誘導細胞膜電位變化；
（4）測定di-8-標記細胞膜的螢光硬度變化，并通過細胞螢光硬度與外加電場之間的線性多項式，得到細胞膜在微囊泡誘導下電位變化。
所述的一種微囊泡誘導細胞膜電位變化的無損檢查方式，其特點在于所述的步驟（2）中外加電場硬度為100-500mv。
所述的一種微囊泡誘導細胞膜電位變化的無損檢查方式，其特點在于所述的步驟（3）中微囊泡為脂肪酸和乙酸自組裝產生的微囊泡。
上述的一種微囊泡誘導細胞膜電位變化的無損檢查方式，設計合理，與現有技術相比具有以下有益療效：
1、本發明提供了一種以本發明通過螢光顯微鏡觀察di-8-標記的細胞膜螢光硬度的變化，可以有效、連續測定細胞的膜電位變化。
2、本發明最大的特征在于對被測細胞沒有損傷，實現無損、精確檢測，快捷、動態地反應出細胞膜隨環境變化導致的膜電位極化變化趨勢，可以有效反映出微囊泡與細胞互相作用導致細胞結構與生理變化。
3、本發明借助自組裝產生微囊泡誘導細胞膜電位變化。
4、本發明為在靜電引力、范德華力和官能團作用，造成細胞表面電荷密度的改變，誘導膜中蛋白質等其他分子的構型變化導致膜電位變化的無損檢查提供有效方式。
附圖說明
圖1為進行微囊泡誘導細胞膜電位無損檢查方式的裝置圖；
圖2為施行例2中螢光硬度與細胞膜電位之間的關系圖；
圖3為施行例3中螢光中度與外加電場成線性相關圖；
圖4為施行例4中不同鏈長不同含量脂肪酸對iec-6細胞膜電位螢光硬度影響圖；
圖5為施行例5中不同鏈長乙酸（cn=6，7，8）對iec-6細胞膜電位螢光硬度影響圖。
具體施行方法
以下結合施行例來進一步說明本發明。
施行例1：一種微囊泡誘導細胞膜電位無損檢查方式，包括以下步驟：
（1）以di-8-為螢光顏料標記細胞膜；
（2）通過脈沖發生器調節電場變化（100-500mv），使細胞螢光硬度與外加電場成線性相關；
（3）通過微囊泡（脂肪酸和乙酸自組裝產生的微囊泡，如鏈長為c4-c9的脂肪酸，鏈長為c4-c8的乙酸）誘導細胞膜電位變化；
（4）測定di-8-標記細胞膜的螢光硬度變化，并通過細胞螢光硬度與外加電場之間的線性多項式，得到細胞膜在微囊泡誘導下電位變化。
本發明用到的試驗裝置如圖1所示，包括了pc、外加電場裝置、顯微鏡等。
施行例2
采用膜電位顏料di-8-測定iec-6膜電位的變化，di-8-是一種對膜電位高度敏感的染色劑，能特異性地分布在細胞膜表面，使細胞膜呈現螢光，電位的高低將變化di-8-的螢光硬度分布含量。電位高，di-8-螢光顯色為黃色或桔黃色；反之則為白色，螢光硬度之比增加則意味著iec-6細胞膜電位的增加，如圖2所示。
施行例3
經過di-8-膜螢光顏料標記的iec-6細胞，在外加電場作用（100-500mv）對iec-6細胞表鼻貼電位的影響，采用leica倒置螢光顯微鏡進行成像觀察，leica剖析軟件采用剖析圖象，獲得iec-6細胞表鼻貼電位定量曲線；從iec-6細胞表鼻貼電位的變化來看，iec-6細胞表鼻貼電位與外加電場成線性相關，隨著外加電場的不斷降低，iec-6細胞表鼻貼螢光硬度不斷減少，如圖3所示。
施行例4
因為不同鏈長脂肪酸會產生自組裝，脂肪酸親水頭基的電荷作用將改變iec-6細胞膜偶極，導致膜電位的變化。通過對不同脂肪酸在不同含量值對iec-6細胞膜電位變化的影響，測得螢光波譜數據，不同鏈長脂肪酸不同含量造成膜顏料螢光硬度的變化，反應了細胞膜電位的變化，如圖4所示。
施行例5
因為不同鏈長乙酸會產生自組裝，乙酸親水頭基的電荷作用將改變iec-6細胞膜偶極，導致膜電位的變化。通過對不同鏈長乙酸對iec-6細胞膜電位變化的影響，測得螢光波譜數據，不同鏈長乙酸造成膜顏料螢光硬度的變化，反應了細胞膜電位的變化，如圖5所示。
技術特點：
技術總結
一種微囊泡誘導細胞膜電位變化的無損檢查方式，屬于細胞膜聯通號剖析技術領域。其包括以下步驟：以Di?8?為螢光顏料標記細胞膜；通過脈沖發生器調節電場變化，使細胞螢光硬度與外加電場成線性相關；通過微囊泡誘導細胞膜電位變化；測定Di?8?標記細胞膜的螢光硬度變化，并通過細胞螢光硬度與外加電場之間的線性多項式，得到細胞膜在微囊泡誘導下電位變化。該方式通過采用膜電位敏感螢光探針Di?8?標記細胞膜，采用微囊泡誘導細胞膜電位變化，通過螢光硬度的強弱反映了細胞膜電位的變化，且不影響細胞壽命。
技術研制人員：陳麗春;鄧少平
受保護的技術使用者：山東科技大學
技術研制日：2017.04.27
技術公布日：2017.09.26