本發(fā)明屬于細(xì)胞膜聯(lián)通號(hào)剖析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無(wú)損檢查方式。
背景技術(shù)：
生物膜中脂類(lèi)排列成雙分子層，在膜中每位類(lèi)脂分子均可縱向運(yùn)動(dòng)，也可以發(fā)生轉(zhuǎn)動(dòng)和聯(lián)接的活動(dòng)，致使生物膜具有柔硬度、流動(dòng)性、高內(nèi)阻性以及對(duì)高分子的不透過(guò)性。固醇包括乙酸甘油酯(即磷脂)、鞘脂質(zhì)和甾體，這種成份的有序排列及互相作用，產(chǎn)生了細(xì)胞膜特定的結(jié)構(gòu)與生物功能。脂類(lèi)均由一疏水部份和極性端基構(gòu)成，磷脂或乙酸酯的極性端基間常能產(chǎn)生構(gòu)象，大多數(shù)脂類(lèi)的疏水部份為兩個(gè)脂肪族雙鏈。生物膜表面帶電主要誘因是組成生物膜的磷脂或生物大分子)帶有帶電側(cè)鏈（如氨基酸鏈的甲基末端和羥基末端）；導(dǎo)致生物膜內(nèi)兩側(cè)的電荷不致具有一定的電位。
膜電位對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及酶活性等至關(guān)重要，造成細(xì)胞生長(zhǎng)和分化異常、細(xì)胞功能衰弱。一些具有帶電性的蛋白質(zhì)甚至dna鏈也會(huì)在膜上的特定微區(qū)-“脂筏”。脂筏組裝體是鞘磷脂緊密有序的排列，鞘磷脂所含長(zhǎng)鏈飽和脂肪鏈，相變氣溫差，脂肪鏈流動(dòng)性差，造成混和膜發(fā)生相分離。以脂單層分子的疏水端為界細(xì)胞膜電位，生物膜可分為近胞質(zhì)面和非胞質(zhì)面內(nèi)外兩層，使生物膜具有不對(duì)稱(chēng)性。同時(shí)膜脂、膜蛋白和復(fù)合糖在膜上均呈不對(duì)稱(chēng)分布，造成膜具有不對(duì)稱(chēng)性和方向性，進(jìn)而使膜內(nèi)外兩層的流動(dòng)性不同，使物質(zhì)傳遞有一定方向，訊號(hào)的接受和傳遞也有一定的方向性。
生物親脂性的顏料分子在膜的取向，顯示膜周?chē)幕瘜W(xué)和物理性質(zhì)。偶極是一個(gè)內(nèi)部潛在生物膜膜脂類(lèi)和水份子的界面的因?yàn)榉请S機(jī)生成和電偶極的取向。按照細(xì)胞膜的成份不同，偶極在為200-范圍中，偶極可能影響膜蛋白和氨基酸等na+/k+和離子通道。
細(xì)胞膜內(nèi)外具有不同的電位，常用膜邊鑷來(lái)測(cè)定細(xì)胞膜的電極電位，此方式對(duì)顯微觀察設(shè)備、實(shí)驗(yàn)操作精確度要求比較高，主要采用探針尖端刺入被測(cè)細(xì)胞中，同時(shí)容易對(duì)細(xì)胞導(dǎo)致?lián)p傷。探針di-8-穩(wěn)定螢光發(fā)光官能團(tuán)坐落膜表面距離中心近200um,電荷轉(zhuǎn)移螢光波譜變化與螢光探針di-8-電場(chǎng)硬度相關(guān)，通過(guò)外加電場(chǎng)的改變來(lái)調(diào)控細(xì)胞膜的膜電位響應(yīng)情況，結(jié)合雙波長(zhǎng)螢光百分比估算方式，用螢光探針標(biāo)記細(xì)胞膜測(cè)定膜電位的變化細(xì)胞膜電位，借助電場(chǎng)造成di-8-改變螢光硬度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無(wú)損測(cè)量的技術(shù)方案。該方式通過(guò)采用膜電位敏感螢光探針di-8-標(biāo)記細(xì)胞膜，采用微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化，通過(guò)螢光硬度的強(qiáng)弱反映了細(xì)胞膜電位的變化，且不影響細(xì)胞壽命。
所述的一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無(wú)損檢查方式，其特點(diǎn)在于包括以下步驟：
（1）以di-8-為螢光顏料標(biāo)記細(xì)胞膜；
（2）通過(guò)脈沖發(fā)生器調(diào)節(jié)電場(chǎng)變化，使細(xì)胞螢光硬度與外加電場(chǎng)成線性相關(guān)；
（3）通過(guò)微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化；
（4）測(cè)定di-8-標(biāo)記細(xì)胞膜的螢光硬度變化，并通過(guò)細(xì)胞螢光硬度與外加電場(chǎng)之間的線性多項(xiàng)式，得到細(xì)胞膜在微囊泡誘導(dǎo)下電位變化。
所述的一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無(wú)損檢查方式，其特點(diǎn)在于所述的步驟（2）中外加電場(chǎng)硬度為100-500mv。
所述的一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無(wú)損檢查方式，其特點(diǎn)在于所述的步驟（3）中微囊泡為脂肪酸和乙酸自組裝產(chǎn)生的微囊泡。
上述的一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無(wú)損檢查方式，設(shè)計(jì)合理，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益療效：
1、本發(fā)明提供了一種以本發(fā)明通過(guò)螢光顯微鏡觀察di-8-標(biāo)記的細(xì)胞膜螢光硬度的變化，可以有效、連續(xù)測(cè)定細(xì)胞的膜電位變化。
2、本發(fā)明最大的特征在于對(duì)被測(cè)細(xì)胞沒(méi)有損傷，實(shí)現(xiàn)無(wú)損、精確檢測(cè)，快捷、動(dòng)態(tài)地反應(yīng)出細(xì)胞膜隨環(huán)境變化導(dǎo)致的膜電位極化變化趨勢(shì)，可以有效反映出微囊泡與細(xì)胞互相作用導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生理變化。
3、本發(fā)明借助自組裝產(chǎn)生微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化。
4、本發(fā)明為在靜電引力、范德華力和官能團(tuán)作用，造成細(xì)胞表面電荷密度的改變，誘導(dǎo)膜中蛋白質(zhì)等其他分子的構(gòu)型變化導(dǎo)致膜電位變化的無(wú)損檢查提供有效方式。
附圖說(shuō)明
圖1為進(jìn)行微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位無(wú)損檢查方式的裝置圖；
圖2為施行例2中螢光硬度與細(xì)胞膜電位之間的關(guān)系圖；
圖3為施行例3中螢光中度與外加電場(chǎng)成線性相關(guān)圖；
圖4為施行例4中不同鏈長(zhǎng)不同含量脂肪酸對(duì)iec-6細(xì)胞膜電位螢光硬度影響圖；
圖5為施行例5中不同鏈長(zhǎng)乙酸（cn=6，7，8）對(duì)iec-6細(xì)胞膜電位螢光硬度影響圖。
具體施行方法
以下結(jié)合施行例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
施行例1：一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位無(wú)損檢查方式，包括以下步驟：
（1）以di-8-為螢光顏料標(biāo)記細(xì)胞膜；
（2）通過(guò)脈沖發(fā)生器調(diào)節(jié)電場(chǎng)變化（100-500mv），使細(xì)胞螢光硬度與外加電場(chǎng)成線性相關(guān)；
（3）通過(guò)微囊泡（脂肪酸和乙酸自組裝產(chǎn)生的微囊泡，如鏈長(zhǎng)為c4-c9的脂肪酸，鏈長(zhǎng)為c4-c8的乙酸）誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化；
（4）測(cè)定di-8-標(biāo)記細(xì)胞膜的螢光硬度變化，并通過(guò)細(xì)胞螢光硬度與外加電場(chǎng)之間的線性多項(xiàng)式，得到細(xì)胞膜在微囊泡誘導(dǎo)下電位變化。
本發(fā)明用到的試驗(yàn)裝置如圖1所示，包括了pc、外加電場(chǎng)裝置、顯微鏡等。
施行例2
采用膜電位顏料di-8-測(cè)定iec-6膜電位的變化，di-8-是一種對(duì)膜電位高度敏感的染色劑，能特異性地分布在細(xì)胞膜表面，使細(xì)胞膜呈現(xiàn)螢光，電位的高低將變化di-8-的螢光硬度分布含量。電位高，di-8-螢光顯色為黃色或桔黃色；反之則為白色，螢光硬度之比增加則意味著iec-6細(xì)胞膜電位的增加，如圖2所示。
施行例3
經(jīng)過(guò)di-8-膜螢光顏料標(biāo)記的iec-6細(xì)胞，在外加電場(chǎng)作用（100-500mv）對(duì)iec-6細(xì)胞表鼻貼電位的影響，采用leica倒置螢光顯微鏡進(jìn)行成像觀察，leica剖析軟件采用剖析圖象，獲得iec-6細(xì)胞表鼻貼電位定量曲線；從iec-6細(xì)胞表鼻貼電位的變化來(lái)看，iec-6細(xì)胞表鼻貼電位與外加電場(chǎng)成線性相關(guān)，隨著外加電場(chǎng)的不斷降低，iec-6細(xì)胞表鼻貼螢光硬度不斷減少，如圖3所示。
施行例4
因?yàn)椴煌滈L(zhǎng)脂肪酸會(huì)產(chǎn)生自組裝，脂肪酸親水頭基的電荷作用將改變iec-6細(xì)胞膜偶極，導(dǎo)致膜電位的變化。通過(guò)對(duì)不同脂肪酸在不同含量值對(duì)iec-6細(xì)胞膜電位變化的影響，測(cè)得螢光波譜數(shù)據(jù)，不同鏈長(zhǎng)脂肪酸不同含量造成膜顏料螢光硬度的變化，反應(yīng)了細(xì)胞膜電位的變化，如圖4所示。
施行例5
因?yàn)椴煌滈L(zhǎng)乙酸會(huì)產(chǎn)生自組裝，乙酸親水頭基的電荷作用將改變iec-6細(xì)胞膜偶極，導(dǎo)致膜電位的變化。通過(guò)對(duì)不同鏈長(zhǎng)乙酸對(duì)iec-6細(xì)胞膜電位變化的影響，測(cè)得螢光波譜數(shù)據(jù)，不同鏈長(zhǎng)乙酸造成膜顏料螢光硬度的變化，反應(yīng)了細(xì)胞膜電位的變化，如圖5所示。
技術(shù)特點(diǎn)：
技術(shù)總結(jié)
一種微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化的無(wú)損檢查方式，屬于細(xì)胞膜聯(lián)通號(hào)剖析技術(shù)領(lǐng)域。其包括以下步驟：以Di?8?為螢光顏料標(biāo)記細(xì)胞膜；通過(guò)脈沖發(fā)生器調(diào)節(jié)電場(chǎng)變化，使細(xì)胞螢光硬度與外加電場(chǎng)成線性相關(guān)；通過(guò)微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化；測(cè)定Di?8?標(biāo)記細(xì)胞膜的螢光硬度變化，并通過(guò)細(xì)胞螢光硬度與外加電場(chǎng)之間的線性多項(xiàng)式，得到細(xì)胞膜在微囊泡誘導(dǎo)下電位變化。該方式通過(guò)采用膜電位敏感螢光探針Di?8?標(biāo)記細(xì)胞膜，采用微囊泡誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位變化，通過(guò)螢光硬度的強(qiáng)弱反映了細(xì)胞膜電位的變化，且不影響細(xì)胞壽命。
技術(shù)研制人員：陳麗春;鄧少平
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東科技大學(xué)
技術(shù)研制日：2017.04.27
技術(shù)公布日：2017.09.26