簡(jiǎn)介
補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，是拿來判定補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒活性。
原理
補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)的基本原理是細(xì)胞性抗體與特異性抗原（IgG1,2,3或IgM）結(jié)合激活補(bǔ)體活化的精典途徑細(xì)胞膜損傷，補(bǔ)體活化形成的攻膜復(fù)合體可導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，損傷細(xì)胞膜私密性改變，而使細(xì)胞外低滲的液體步入細(xì)胞，造成細(xì)胞水腫死亡，可以通過顯微鏡計(jì)數(shù)死細(xì)胞的多少，來判定補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒活性。
用途
補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)可用于該實(shí)驗(yàn)可拿來測(cè)量細(xì)胞表面特異性的抗體，也可用于測(cè)量制備的抗原是否具有細(xì)胞毒性（并非所有抗原與抗體結(jié)合后都能激活補(bǔ)體，尤其是單克隆抗原）、淋巴細(xì)胞亞群的鑒別、組織相容性抗體的檢測(cè)與分型、選擇性除去某一細(xì)胞亞群、單克隆抗原的篩選與鑒別。
材料與儀器
器材：解剖器材、平皿、試管、滴管、載玻片、蓋玻片、顯微鏡、水浴箱。
試劑：
①補(bǔ)體：新鮮家兔混和血漿，分裝后保存于-20℃，用時(shí)以Hanks液進(jìn)行適當(dāng)稀釋；
②抗Thy-1血漿、PBS、0.5%錐蟲亂菊液;
步驟
補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)（以抗Thy-1血漿與大鼠的胸腺或脾T淋巴細(xì)胞互相作用，通過激活補(bǔ)體對(duì)胸腺或脾的T細(xì)胞進(jìn)行殺傷為示例）的基本過程可分為如下幾步：
（一）靶細(xì)胞的制備
A.大鼠骨折處決細(xì)胞膜損傷，取出肝臟和胸腺（分別坐落右邊頭部和肋骨柄后）分別放在富含3mlPBS平皿中，將3-4層紗布覆蓋到組織上，用直頭鉗子固定組織，用管件鉗子輕壓組織，將其碾磨成單細(xì)胞懸液，之后用滴管隔著紗布將細(xì)胞懸液吸出，調(diào)細(xì)胞含量至5x106/ml。
注意事項(xiàng)：鼠處決要迅速、徹底，避免流血過多，不利于胸腺的分離，亦可事先摘眼珠放血。
（二）加樣
A.分別向陰性管中加入100μl靶細(xì)胞＋100μl抗Thy-1的McAb，陽性對(duì)照管則加入100μl靶細(xì)胞＋100μlPBS，同時(shí)向各管中各加入100μl補(bǔ)體。輕輕振蕩混勻后，置37℃水浴中孵育40分鐘。
注意事項(xiàng)：靶細(xì)胞須要新鮮分離獲得，否則長時(shí)間放置可引起細(xì)胞自然死亡而影響結(jié)果；靶細(xì)胞含量要適中，過低或過高均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。補(bǔ)體要新鮮采集，需三只以上的家兔的血漿混和。
（三）觀察
A.細(xì)胞孵育后，取出試管，于每管中各加入50μl錐蟲亂菊液，振搖混勻后立刻取出染色的細(xì)胞懸液滴1滴到玻片上，用蓋玻片蓋上，在顯微鏡下觀察。
錐蟲藍(lán)拒染法測(cè)量細(xì)胞活力具體方式：取一定量細(xì)胞懸液離心1000r/min，5分鐘，棄上清，沉淀細(xì)胞用PBS或無血漿培養(yǎng)基重懸后，與適量0.5％錐蟲藍(lán)染色液混和，溫度下孵育3分鐘。于3～5分鐘內(nèi)，將混和液滴于計(jì)數(shù)板上置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)未著色細(xì)胞（活細(xì)胞）和著色細(xì)胞（死細(xì)胞）。根據(jù)下邊公式估算細(xì)胞活力：
注意事項(xiàng)：錐蟲藍(lán)染色時(shí)間及計(jì)數(shù)時(shí)間不要太長，因錐蟲藍(lán)本身具有一定的毒性作用，可致細(xì)胞死亡。
（四）結(jié)果判斷
按下式估算細(xì)胞毒百分比：
注意事項(xiàng)
1.大鼠處決要迅速、徹底，避免流血過多，不利于胸腺的分離，亦可事先摘眼珠放血。
2.靶細(xì)胞須要新鮮分離獲得，否則長時(shí)間放置可引起細(xì)胞自然死亡而影響結(jié)果。
3.靶細(xì)胞含量要適中，過低或過高均會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4.補(bǔ)體要新鮮采集，需三只以上的家兔的血漿混和。
5.錐蟲藍(lán)染色時(shí)間及計(jì)數(shù)時(shí)間不要太長，因錐蟲藍(lán)本身具有一定的毒性作用，可致細(xì)胞死亡。