對(duì)于菜鳥(niǎo)小白來(lái)說(shuō)細(xì)胞膜教具圖，免疫螢光染色可謂玄學(xué)，片子能不能染上，療效又怎樣，只能待到鏡下檢驗(yàn)。
明天丁香實(shí)驗(yàn)給你們整理了免疫螢光染色從「樣本制備」到「問(wèn)題剖析」的全流程，建議轉(zhuǎn)發(fā)收藏！
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第一步
樣本制做
以冰凍切塊為例：首先將組織放在多聚甲醛固定過(guò)夜，30%蔗糖脫水后用包埋劑放在-20℃冷凍臺(tái)上進(jìn)行冰凍。
將冷藏好的組織塊修平，根據(jù)不同的組織調(diào)整好預(yù)切長(zhǎng)度，腦組織通常貼片長(zhǎng)度為15-25um。切好的片子溫度蒸熟后再進(jìn)行后續(xù)染色處理。
點(diǎn)此查看冰凍切塊實(shí)驗(yàn)
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不同的樣本預(yù)處理方式不同，關(guān)于細(xì)胞樣本制備：貼壁細(xì)胞樣本基本原理是使細(xì)胞生長(zhǎng)在合適的液相支持物玻片上，之后進(jìn)行固定。
細(xì)胞樣本的制備
細(xì)胞樣本的制備
細(xì)胞樣本的制備
第二步
螢光染色
按照一抗是否直接帶螢光標(biāo)記，將免疫螢光染色分為直接染色或間接染色。
直接染色法是攜帶螢光素的抗原直接與標(biāo)本內(nèi)的抗體反應(yīng)，產(chǎn)生抗體—熒光素標(biāo)記抗原復(fù)合物，該法優(yōu)點(diǎn)是較簡(jiǎn)單，特異性較高；缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍較窄，敏感性也較低。
實(shí)際上在實(shí)驗(yàn)室中，我們最常使用的還是間接染色法，先用特異性抗原與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)抗體結(jié)合，再用螢光素標(biāo)記的二抗與特異性抗原相結(jié)合，產(chǎn)生抗體-特異性抗原-標(biāo)記螢光抗原的復(fù)合物。
下邊大師妹就以間接染色法為例展開(kāi)表述：
實(shí)驗(yàn)步驟：
復(fù)溫：取出制做好的樣本（短期儲(chǔ)存-20℃，常年儲(chǔ)存-80℃保存），恢復(fù)至溫度后細(xì)胞膜教具圖，用1xPBS漂洗三次，每次5分鐘；
抗體修補(bǔ)：用0.01M枸櫞絡(luò)合物緩沖液（pH6.0）充分曝曬樣本，微波爐中低火加熱修補(bǔ)，保持微沸狀態(tài)5min療效最好；
破膜：用0.5%X-100(1xPBS配制)溫度通透20min（細(xì)胞膜上抒發(fā)的抗體省略此步驟）；
封閉：封閉液蛋白的選擇原則是與一抗蛋白和目標(biāo)蛋白種屬不同，將非特異性位點(diǎn)結(jié)合掉，因而保證后續(xù)螢光染色的特異性。
一抗孵育：用抗原稀釋液將一抗稀釋成目標(biāo)比列，4℃過(guò)夜。
一抗洗脫：第二天將濕盒掏出復(fù)溫30min,用1xPBS洗脫三次，每次5min；
螢光二抗：用抗原稀釋液稀釋螢光二抗，溫度孵育2h,注意避光;
二抗洗脫：用1xPBS洗脫三次，每次洗脫時(shí)間可稍長(zhǎng)一些；
封片：用含防淬滅的甘油進(jìn)行封片，按需可以對(duì)細(xì)胞核用DAPI進(jìn)行染色；
胸片：蒸熟片子后，放在顯微鏡下觀察，獲取螢光圖象。