2003年10月8日，西班牙皇家科大學(xué)將2003年諾貝爾物理獎授予時為TheJohnsof生物物理系（現(xiàn)為Duke醫(yī)學(xué)中心副所長）的PeterAgre院士，以嘉獎他發(fā)覺細胞膜水通道并證明其功能這一開創(chuàng)性貢獻。
Agre院長1949年出生于法國，他的祖先輩們在19世紀(jì)末從英國和愛爾蘭移民到了澳大利亞。其父
Agre結(jié)業(yè)于，并獲得了物理學(xué)士和博士學(xué)位。二戰(zhàn)期間曾是3M即猶他礦務(wù)及制造業(yè)公司的物理專家，負責(zé)實驗室合成多聚物。二戰(zhàn)后先后成為St.Olaf和物理系的一位班主任。PeterAgre院士能從事基礎(chǔ)研究，與從小受其父影響不無關(guān)系。
身為細胞生物學(xué)的院士，Peter院士并非科班出身于分子生物學(xué)。1967年至1970年，他就讀于，的物理專業(yè)，并獲得學(xué)士學(xué)位。1970年至1974年，步入Johnsof獲醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，并在1981年獲得醫(yī)師執(zhí)照。
1974年至1975年，PeterAgre在Johns毒理學(xué)系Pedro的實驗室進行博士后的研究。1984年，Peter在TheJohns的theold構(gòu)建了第一個自己的實驗室。當(dāng)時作為血液學(xué)家，Peter和助手Andy開始研究球狀紅細胞增多癥（），并分別與1985年和1986年在和Newof上發(fā)表了相關(guān)文章，證明血影蛋白（）欠缺與臨床上球狀細胞增多癥（）的嚴(yán)重程度有關(guān)。
一、細胞膜水轉(zhuǎn)運的研究導(dǎo)論
20世紀(jì)20年代，隨著對細胞膜的脂類雙分子結(jié)構(gòu)的認識，人們普遍覺得水是以簡單擴散的方式通過細胞的脂類雙分子層——即水份子的簡單擴散學(xué)說。研究水的私密性有兩個指標(biāo)，擴檐口私密性（water,Pd）和滲透水私密性（water,Pf)。所有組織細胞膜都容許水的簡單擴散。不同組織的Pd值不同，但變異不大。Pd值較低，約為10mm/s，并呈現(xiàn)出室溫依賴性；水份子的簡單擴散須要較高的阿侖尼烏斯活化能（,以下簡稱Ea），Ea>10kca/mol。膜脂類的分子組成和流動性影響水的擴散，故水份子的簡單擴散不能被汞等通道蛋白阻斷劑所抑制。滲透水私密性Pf反映的是水在跨膜梯度存在下的滲透情況。假如Pf/Pd值近似為1則表明水的跨膜運動是通過簡單擴散完成的。
但是水份子簡單擴散理論不能解釋一些生理現(xiàn)象，如尿的濃縮、Pf/Pd>1時水的轉(zhuǎn)運以及有些細胞水轉(zhuǎn)運可被通道蛋白阻斷劑抑制等，所以就形成了另一種理論，覺得細胞膜上存在水份子轉(zhuǎn)運的特殊通道，即水通道學(xué)說。水通過水通道時須要的Ea較低，通常Ea<5kcal/mol。這些通道具有高度的選擇性，水穿過這樣的細胞膜幾乎沒有阻力，而堿性的水合氫離子（H3O+）卻不能滲過這些細胞膜。
在上世紀(jì)六七十年代，水轉(zhuǎn)運領(lǐng)域的先驅(qū)們首先提出水通道蛋白的存在，這種高手們包括：波士頓的亞瑟·克·所羅門（K.）、紐約的艾倫·菲克爾斯代恩（Alan）、伯克利的羅伯特·梅茲（Macey）、羅馬尼亞的喬治·本格（Benga）、委內(nèi)瑞拉的蓋勒姆·懷特姆拜瑞（）和法國的馬里奧·潘瑞斯（Mario）。她們通過生物化學(xué)的方式否認了水通道存在于對水具有高滲透性的一些細胞中，如腎小管、唾液腺、紅細胞。Macey等進一步否認了水穿越紅細胞膜可被有機汞劑型所抑制，撤消抗生素后紅細胞對水的私密性可以恢復(fù)，提示膜上存在一種對汞劑型敏感的水通道蛋白。Pf/Pd遠遠小于1也支持有水通道存在。
但要鑒別水通道的分子結(jié)構(gòu)仍是一個十分困難的問題。在Peter之前，一些科學(xué)家曾企圖克隆水通道，但無法成功。汞核素標(biāo)記出了幾種膜蛋白，標(biāo)記了陰離子交換蛋白（波長3），Benga標(biāo)記了一組中的幾個蛋白（波長4.5）。但是，她們都沒有分離出轉(zhuǎn)運水的蛋白。
二、第一個水通道蛋白——AQP1的發(fā)覺
1988年P(guān)eterAgre還是一名血液病學(xué)家，當(dāng)時他正在研究Rh血型抗體，打算增強小鼠體內(nèi)的抗原數(shù)目以改變部份純化的Rh氨基酸的性質(zhì)。在分離Rh氨基酸（32kD）時，同時得到了一個分子量稍小的28kD蛋白。由于這兩種蛋白的一些物化和生化性質(zhì)相像，因此開始時覺得28KD是Rh氨基酸的裂解物。而后PeterAgre實驗室的博士后Brad和助手Smith采用去垢劑的方式純化這些蛋白質(zhì)。聚乙烯十二羥基磺酸鈉凝膠電泳（SDS-PAGE）銀染法在去垢劑分離析出物中發(fā)覺了一條28kD的不連續(xù)的條帶。此蛋白與X-100不溶化的膜骨架蛋白聯(lián)接。定量免疫印跡（）表明每位紅細胞有~個28kD的拷貝。純化的小鼠腎組織28kD與小鼠紅細胞28kD十分相像。人腎組織28kD抗原免疫組織物理染色表明，近曲小管的頂端刷狀緣有28kD的顯著抒發(fā)，因不能被常規(guī)的蛋白質(zhì)染色劑如考馬斯亮藍著色，所以此蛋白沒有被發(fā)覺過，功能也是未知的。
但是在后續(xù)的研究中，和two-maps均表明Rh氨基酸和28kD蛋白是完全不同的，在結(jié)構(gòu)上亦沒有同源性。用羧肽酶選擇性消化完整的紅細胞和內(nèi)膜內(nèi)翻的囊泡表明胞顯存在5kD的甲基末端區(qū)域。28kD紅細胞跨膜蛋白有兩種方式，28kD和。多項研究否認28kD和蛋白共同組成一個四亞基低聚物。純化的28kD甲基端前35個多肽殘基序列與26kD的鞏膜主要內(nèi)部蛋白有37%的相像。
PeterAgre實驗室的博士后等從一個人骨髓的cDNA文庫中克隆和分離了28kD蛋白的cDNA。它的編碼區(qū)對應(yīng)的是一個269個多肽的氨基酸，通過酯化法剖析喻示著它有六個雙分子跨膜區(qū)域，兩個可能的膜外N-糖基化位點，甲基端和甲基端均在細胞內(nèi)。這個分子的甲基端和甲基端在起源上有20%是相同的。B環(huán)和E環(huán)有更高的相關(guān)性，每一個環(huán)都包含了保守的模序——天冬谷氨酸、脯谷氨酸和谷氨酸（NPA）序列。28kD與已知的所有NIP蛋白家族有同源性。majoroflens（MIP26），為電流門控性四聚體，鞏膜的纖維細胞通過MIP26吸收組織。NIP膜蛋白在多個物種中有分布。28kD蛋白最初被稱為，即分子量為28kD的通道構(gòu)成整合膜蛋白。檢索遺傳學(xué)的數(shù)據(jù)庫，發(fā)覺母牛耳朵的鞏膜、果蠅的腦組織、細菌和動物中都存在類似DNA的序列。這種線索進一步提示，這個28kD蛋白可能在水轉(zhuǎn)運中起重要作用。
南非爪蟾卵母細胞抒發(fā)系統(tǒng)是目前公認的研究轉(zhuǎn)移受體、通道、轉(zhuǎn)運子、部分酶等基因功能的細胞系統(tǒng)。因為它天然不抒發(fā)水孔蛋白，對水的私密性極低，對于研究水孔蛋白轉(zhuǎn)運水的功能是一個理想的細胞模型。加洲學(xué)院醫(yī)學(xué)部的院士實驗室在1990年做過研究，向南非爪蟾卵母細胞中微量注入水或腎皮層和腎乳房mRNA（此三者為小鼠來源），以及網(wǎng)織紅細胞、腦、肌肉mRNA（此兩者為小鼠來源），測量滲透梯度變化時卵母細胞滲透水私密性Pf值。結(jié)果顯示，來自紅細胞，腎近曲小管（皮層）和腎集合管（乳房）的水通道才能在爪蟾卵母細胞功能性抒發(fā)，說明水通道是一種蛋白，而將腎mRNA注人爪蟾卵母細胞也可用于研究水通道克隆抒發(fā)。1991年院士實驗室又借助-flowlight技術(shù)做實驗。她們測量小鼠紅細胞滲透水私密性Pf值，HgCl2等物質(zhì)對Pf值的影響以及反應(yīng)自由能Ea，證明在所有已研究的喂奶植物紅細胞中，豚鼠紅細胞的Pf值最大，而在已研究物質(zhì)中HgCl2對Pf的抑制作用最強。觀察美洲爪蟾卵母細胞注入50nl水或則注人家兔網(wǎng)織紅細胞未分裂的mRNA（1mg/m1）前后滲透水私密性Pf值，HgCl2等物質(zhì)對Pf值的影響以及反應(yīng)自由能Ea的變化。結(jié)果表明，紅細胞和注人家兔網(wǎng)織紅細胞未分裂mRNA的爪蟾卵母細胞中水通道的特點相像，紅細胞中的水通道是可以被克隆抒發(fā)的。
1992年，PeterAgre及其在霍普金斯學(xué)院的朋友Bill協(xié)作，測試了28kD蛋白可能的水轉(zhuǎn)運功能。她們采用肯尼亞爪螗卵母細胞，對照卵母細胞注射水，實驗卵母細胞注射2ng的的cRNA。一天后，對照組和實驗組卵母細胞容積完全一樣。將其轉(zhuǎn)移到分餾水底細胞膜通道，由于對照組的卵細胞對水的私密性十分低，細胞沒有膨脹。產(chǎn)生鮮明對比的是，實驗組的卵母細胞對水具有高度的滲透性，像爆米花一樣膨脹。這個蛋白因而被命名為水通道蛋白，后來被即將命名為AQP1，它是第一個被定義為水通道的蛋白。
PeterAgre在霍普金斯學(xué)院的同學(xué)等（1992），使用人工合成的半徑大于0.1mm的脂類囊，向其注人再生純化的。研究進一步否認專情性轉(zhuǎn)運水的特點而不是誘導(dǎo)或調(diào)控爪蟾卵母細胞中水通道的抒發(fā)。
等（1994），PeterAgre在英國奧爾胡斯學(xué)院的同學(xué)，通過高溫電子顯微鏡對這此簡單的囊泡的膜進行了檢驗。當(dāng)再造的脂類不富含蛋白質(zhì)時，它的表面是光滑的，而當(dāng)脂類膜中富含AQP1蛋白時，膜的內(nèi)部就可看見許多半徑0.01mm的小洞。
此后，PeterAgre實驗室又對人的AQP1基因序列進行了研究。實驗顯示，AQP1有四個外顯子，編碼多肽第1~128、129~183、184~210和211~269位序列，將內(nèi)含子分隔為9.6kb、0.43kb和0.80kb三部份。其基困的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物約為3.lkb。原位雜交AQP-CHIP基因定位于人染色體7p14處。AQI-CHIP與不同物種相像蛋白的cDNA序列比較，進化來源相同。
細胞膜水通道的發(fā)覺（二）
三、AQP1的結(jié)構(gòu)
按照Macey的研究，汞試劑可通過與半胱谷氨酸的吡啶反應(yīng)抑制水通道的活性。從AQP1的氨基酸中發(fā)覺了4個半胱谷氨酸（87、192、152和189位）。每位半胱谷氨酸被替代為丙氨酸，比較卵母細胞的重組體中突變型和野生型AQP對水的私密性。結(jié)果只有E環(huán)的殘基沒有被汞抑制。在B環(huán)的相應(yīng)位置用一個半胱谷氨酸代替了谷氨酸，這個蛋白顯示出了汞敏感的水私密性。而在AQP1其它位置的置換無法造成這些現(xiàn)象的發(fā)生。這提示這一分子中B環(huán)和E環(huán)的相應(yīng)部份一定產(chǎn)生了沙漏樣的水孔通道。6個跨膜螺旋表明它們圍繞產(chǎn)生一個中心區(qū)域，包含B環(huán)，從細胞質(zhì)表面溶入細胞膜，E環(huán)從細胞外浸人細胞膜。AQP1這樣的結(jié)構(gòu)可以解釋水通道在水的吸收和分泌兩個運動方向上所起的作用。膜上處于反方向相對位置的B環(huán)和E環(huán)對構(gòu)成功能性水選擇通透非常重要。
CHIP兩端序列互相關(guān)聯(lián)，B環(huán)（細胞內(nèi)76~78位）和E環(huán)（細胞外192~194位）均有一個NPA模序（--）。E環(huán)的NPA緊靠汞劑型抑制點189位的半胱谷氨酸。B環(huán)和E環(huán)的重疊部份顯示出它們產(chǎn)生一個單一的水的孔道向上穿過分子的中心，NPA的主要成份并列在一起成180度相聯(lián)。AQP1是一個四聚體，每一個亞單位有一個中心孔道。
在極高的蛋白質(zhì)含量下把再造的AQP1蛋白植入到人工合成的膜中。在此條件下，AQP1蛋白根據(jù)膜晶體結(jié)構(gòu)進行了特別明顯的對稱排列。通過測定水的私密性，否認膜的功能得到了100%的保留，這一點愈發(fā)確信PeterAgre推導(dǎo)入的這一結(jié)構(gòu)就是其生物相關(guān)性結(jié)構(gòu)。
PeterAgre院士在巴塞爾和京都工作的朋友通過高溫電子顯微鏡和原子能顯微鏡提供了人類AQP1在3.8?下的電子密度圖，敘述了AQP1的原子模型。膜雙分子層中間的縱向剖面圖并對單獨的一個AQP1亞單元進行觀察時，通過壁周圍排列著的疏水基可以觀察到單個的水孔，而且在其它壁上排列著兩種NPA基序的高糖前胡丙酯。當(dāng)對其橫向剖面圖進行觀察時，在兩個高糖前胡丙酯間可以看見窄小的水孔。
像水通道這樣不能聯(lián)通的單獨孔是怎樣準(zhǔn)許水快速的通過而不容許質(zhì)子通過的呢？實驗室的BingK.Jap研究了牛科植物紅細胞中AQP1在2.2?氨水中圖象，對AQP1的水孔選擇性地通過水份子而不是其他小分子和離子的機制作了探討。
AQP1選擇性濾過水有三個誘因：第一，AQP1水孔的半徑。AQP1分子的沙漏結(jié)構(gòu)由三部份組成：一個細胞外的通道，一個選擇性轉(zhuǎn)運水的水孔，一個內(nèi)部的通道。這種通道其跨徑大概只有20?，十分窄小。僅容許單個水份子通過。在這個跨距的頂端附近，通道達到了它的最窄小的部份，只有2.8?（大概是一個水份子的半徑）。為此，這個孔道的大小只能容納一個水份子通過；第二，靜電抵觸。在這個位點上，一個被保存完整的精谷氨酸的基團跟在E環(huán)的NPA中心然后并產(chǎn)生一個穩(wěn)定正電荷，在另一個壁上的保存完好的谷氨酸產(chǎn)生另一個部份正電荷，它們一起敵視質(zhì)子以及H3O+；第三，對于質(zhì)子的存在還有另外一道屏障，即單個水份子會形成暫時的偶極旋轉(zhuǎn)同時與并排的兩個NPA主體的基團產(chǎn)生構(gòu)象。據(jù)悉，跨越非雙分子層的項部的a螺旋抵達B環(huán)和E環(huán)有助于部份正電荷妨礙質(zhì)子的傳導(dǎo)。這也表明了汞是如何抑制水份子通過AQP1的：Cys-189的基團沿孔排列，所以假如遭到汞的抵擋，通道才會閉塞。
四、水通道家族的分類及其與癌癥的關(guān)系
水通道的發(fā)覺開辟了一個新的研究領(lǐng)域。目前，科學(xué)家發(fā)覺水通道蛋白廣泛存在于植物、植物和微生物中。在喂奶植物細胞中已發(fā)覺13種亞型（AQP0-AQP12）。值得一提的是，AQP11和AQP12是近日才被確認的水通道亞型。Agre等（2006）在小鼠的心臟、肝臟、睪丸以及腦部組織中發(fā)覺了AQP11RNA和蛋白質(zhì)。AQP11在腦組織中特異分布于浦肯野細胞的樹突，海馬CA1和CA2區(qū)神經(jīng)元，以及皮層神經(jīng)元。浦腎野細胞免疫組化顯示AQP11坐落胞質(zhì)內(nèi)。等（2006）用BLAST方式發(fā)覺了AQP12，blot方式確定AQP12特異抒發(fā)于胰臟。原位雜交以及RT-PCR研究表明AQP12選擇性分布于肝臟的腺泡細胞。免疫雜交顯示AQP12并不定位于膜上。
水通道按其功能特異性可分為兩類：一類具有高度選擇的水私密性，即除水之外不轉(zhuǎn)運其它小分子溶質(zhì)，如AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5、AQP6、AQP8；另一類具有相對選擇的水私密性，AQP3及AQP7對尿素和甘油均具有較高的私密性，而AQP9儀對尿素有私密性。PeterAgre等（2006）的研究表明，在爪螗卵母細胞的細胞膜上抒發(fā)的AQP11不能轉(zhuǎn)運水、甘油、尿素或則其他離子。與水通道家族其他亞型相比，AQP11的功能可能會差異很大。其實AQP11代表一個全新的水通道亞家族。
水通道在組織中的分布表明，水通道基因抒發(fā)異常可能參與個別水平衡衰弱性疾患的發(fā)病。
AQP1是（Co）血型的分子基礎(chǔ)：Co血型抗體是AQP1蛋白坐落胞外的一個特殊區(qū)域。完全欠缺AQP1的人形成的突變段有顯著意義。五級結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重錯義是指38位殘基上的脯谷氨酸弄成了亮谷氨酸。此基因突變造成了無Co表型的形成。在世界范圍內(nèi)已確認了有五個不同的家族完全欠缺Co抗體，人數(shù)十分少。在沒有壓力的狀態(tài)下，AQP1缺位的人沒有臨床上異常表現(xiàn)．在臨床研究中（Agre等2002），AQP1缺位的人在24小時無液體補充狀態(tài)下僅能將精液濃縮至，而正常人同等條件下可以將精液濃縮至小于，且每天當(dāng)午睡無液體補充時均這么。
AQP1是水通道家族中惟一在內(nèi)皮細胞抒發(fā)的亞型，在肺、肌肉、腹膜等組織的毛細血管以及心臟直小血管等內(nèi)皮細胞高抒發(fā)，并介導(dǎo)滲透壓驅(qū)動的高效跨膜和跨內(nèi)皮水轉(zhuǎn)運。另外一些研究發(fā)覺，AQP1在乳房癌、神經(jīng)母細胞瘤、肺癌以及骨髓瘤等多種癌癥的血管內(nèi)皮高抒發(fā)細胞膜通道，故對AQPl與癌癥遷移的研究也漸漸增多。實驗室于2005年4月在上發(fā)表文章，應(yīng)用水通道AQ1敲除大鼠和細胞培養(yǎng)體系，首次證明細胞膜水通道蛋白在血管生成和細胞遷移中發(fā)揮重要作用，證明由細胞膜水私密性決定的跨膜水轉(zhuǎn)運效率會影響細胞遷移行為和相關(guān)的生理和病理過程。實驗室的后續(xù)實驗證明，AQP1才能協(xié)助癌癥細胞遷移、擴散。這種研究表明，高轉(zhuǎn)移性癌癥抒發(fā)的AQPs具有新功能。
AQP2是抗清熱激素（AVP）調(diào)控的水通道蛋白，又稱AQP2-CD（duct)，由東京醫(yī)科牙科學(xué)院的院長于1993年發(fā)覺，僅存在于主細胞和內(nèi)髓部集合管上皮細胞頂膜上。AVP由下額葉和垂體形成，通過作用于心臟集合管的AVP受體2（AVPR2）激活Gs蛋白，剌激cAMP的乙酸化反應(yīng)，使得AQP2移至腎小管集合管的主細胞膜底部，使水份子從低滲狀態(tài)的腎小球腔內(nèi)步入高滲狀態(tài)。腎源性尿崩癥（，NDI）是一種多尿綜合征，因為AVP不能有效地與心臟的AVP受體作用，進而腎小管不能濃縮精液。NDI包括先天性和獲得性兩種。不到10%的常染色體顯性或隱性遺傳是由定位于常染色體12q13上的編碼AQP2基因突變導(dǎo)致（顧鋒等.2002）。
AQP3屬于水-甘油通道亞家族，在大鼠表皮的角化細胞基底進深抒發(fā)，該層細胞向下分化成角化層，而且產(chǎn)生角化層和仿皮層之間的界面。AQP3敲除大鼠表皮結(jié)構(gòu)雖無顯著變化，但濕潤度和彈性顯著增長。表皮甘油濃度增加近50%，屏障功能和損傷修補功能均發(fā)生障礙，給AQP3敲除大鼠口服獲胸腔注射甘油可完全糾正上述所有皮膚功能障礙（等.2002）。
AQP4在腦部和腦干中廣泛抒發(fā)，非常是在參與產(chǎn)生血-腦屏障的星形膠質(zhì)細胞周足處以及室管膜和軟顳葉上皮高抒發(fā)。AQP4缺位使大鼠對急性水中毒和缺血性腦中風(fēng)導(dǎo)致的腦腫脹（以細胞毒性腦腫脹為主）有保護作用，腦腫脹程度減少，死亡率升高。但AQP4缺位對血管性腦腫脹的消除形成不利作用。AQP4敲除大鼠在物理誘導(dǎo)帕金森模型中發(fā)生暈厥的頻度和程度明顯高于野生對照組，表明AQP4參與神經(jīng)元放電活動（馮學(xué)超等.2005）。
AQP5分布于肺的Ⅰ型細胞、上氣道的分泌上皮細胞，在頜下腺、腮腺上皮細胞也有抒發(fā)。部份肺疾患與AQP功能異常相關(guān)。肺膿腫時，液體首先蓄積在支食道周圍，從而步入肺間質(zhì)和肺臟腔。在氧毒性小鼠，肺AQP1和AQP5在肺淤血時抒發(fā)上調(diào)，猜想AQP和AQPs在急性肺損傷時水的清理中起調(diào)節(jié)作用。但AQP1和AQP5作用環(huán)節(jié)不完全一致；AQP1主要是去除支食道和脈管周圍組織的水份，而AQP5則是去除肺臟腔內(nèi)的水份（陶軍等.2000）。頭暈癥也是一種在臨床上較常見的疾病，主要見于頭胸部放射醫(yī)治導(dǎo)致的涎腺損傷，舍格侖綜合征及涎腺良性肥大。目前對頭暈癥的診治除效果短暫的促唾液劑（如毛果云香堿、環(huán)戊六酮及各類唾液代用具）外，尚無其他有效療法。但運用基因療法將AQP5的基因轉(zhuǎn)染至涎腺組織改變細胞膜對水的私密性是一個可行的辦法。
AQP6存在于集合管泌酸細胞和近曲小管上皮細胞的囊泡中。AQP6分布的奇特性喻示了它可能與其他水通道蛋白有功能上的差異，包括對酸堿平衡的調(diào)節(jié)。
以上僅對AQP1-AQP6與癌癥的關(guān)系做簡略概述。在AQP家族中，AQP0和AQP2分布相對集中，AQP11和AQP12的研究處于起步階段，其他亞型的AQP分布都十分廣泛：同一組織或臟器中可能富含多個AQP證型；同一個AQP亞型也可分布于多個組織或臟器中。這一現(xiàn)象表明，不同亞型的水通道蛋白在功能上是互相影響的。
（摘自郭昊,李學(xué)軍.細胞膜上的水通道——2003年諾貝爾物理獎工作介紹.生理科學(xué)進展,2007;38(3):283-289）
（朱大年供稿）