中國醫(yī)科學(xué)院碩士學(xué)位論文術(shù)中自體血回輸對紅細(xì)胞膜水通道蛋白-2（AQP2）和水通道蛋白-4（AQP4）的影響姓名：****請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：麻醉學(xué)指導(dǎo)班主任：**中國醫(yī)科學(xué)院研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性申明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，不僅文中非常加以標(biāo)明和致謝的地方外，論文中不包含其他人早已發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我校或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我一齊工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明晰的說明并表示歉意。申請學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承當(dāng)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名：中國醫(yī)科學(xué)院研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解中國醫(yī)科學(xué)院有關(guān)保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬中國醫(yī)科學(xué)院。本人保證結(jié)業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為中國醫(yī)科學(xué)院，且導(dǎo)師為通信作者，通信作者單位亦署名為中國醫(yī)科學(xué)院。中學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的打印件和c盤，容許論文被查閱和借書。中學(xué)可以公布學(xué)位論文的全部或部份內(nèi)容（保密內(nèi)容除外），以采用翻印、縮印或其他手段保存論文。
論文作者簽名：直！壁盞指導(dǎo)班主任簽名：！墮墮二：英文專著摘要術(shù)中自體血回輸對紅細(xì)胞膜水通道蛋白－２（ＡＯＰ２）和水通道蛋白－４（ＡＯＰ４）的影響闡述術(shù)中自體血回輸對回輸紅細(xì)胞膜水通道蛋白一２（ＡＱＰ一２）和水通道蛋白一４（ＡＱＰ－４）的影響，評估術(shù)中自體血的質(zhì)量，為自體血的臨床應(yīng)用提供理論根據(jù)。方式病例選擇：隨機(jī)選擇擬行自體血回輸?shù)膿衿诜暖熁颊撸保估峙滦g(shù)中失血８００毫升以上，排除術(shù)中應(yīng)用激素和酸性抗生素的病例。標(biāo)本留置：將同一患者不同時點(diǎn)的血液分為２組，新血水組為對照組：局麻誘導(dǎo)成功后經(jīng)中心靜脈導(dǎo)管取血５毫升細(xì)胞膜通道，保存在盛有ＣＰＤＡ．１保存液的試管中，溫度放置；自體血組為實(shí)驗(yàn)組：應(yīng)用自體２０００．型（上海京醫(yī)醫(yī)療設(shè)備廠）血液回收機(jī)回收術(shù)野的失血，經(jīng)吸引，抗凝，高速離心及清洗等多個處理過程得到的紅細(xì)胞懸液，回收完畢后立刻取尿樣７毫升，其中２毫升分別立刻行血常規(guī)和血?dú)馄饰觥z查指標(biāo)：血象、血?dú)馄饰觯ǎ校戎岛脱獕海ⅲ祝澹螅簦澹颍钣≯E檢查標(biāo)本中水通道蛋白－２（ＡＱＰ２）和水通道蛋白一４（ＡＱＰ４）抒發(fā)。統(tǒng)計(jì)學(xué)剖析：所得數(shù)據(jù)均以“均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，實(shí)驗(yàn)組和對照組之間比較用ｔ檢驗(yàn)，用ＳＰＳＳｌ３．０統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)剖析，Ｐ＜０．０５覺得有明顯性差別。
結(jié)果自體血組：血象中白細(xì)胞和血小板顯著降低，紅細(xì)胞變化不顯著；血?dú)馄饰鲋校校戎碉@著下降，血壓升高；Ｗｅｓｔｅｒｎ印跡表明白體血組：水通道蛋白一２（ＡＱＰ．２）和水通道蛋白一４（ＡＱＰ．４）顯著降低；推論術(shù)中自體血回輸過程使紅細(xì)胞膜水通道顯著降低，影響了紅細(xì)胞的微觀形態(tài)，是影響自體血質(zhì)量的誘因之一。關(guān)鍵詞自體血回輸水通道蛋白（ＡＱＰｓ）紅細(xì)胞膜Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｔｒａ—ｏｐｅｒａｔｉｖｅａｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｏｎｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅＡｑｕａｐｏｒｉｎ－－４ｏｂｊｅｃｔｉｖｅＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｅｔｈｅｓｉｓｉｓｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＩｎｔｒａ－ｏｐｅｒａｔｉｖｅＡｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（ＩＡＴ）ｏｎｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅＡｑｕａｐｏｒｉｎ－４Ａｑｕａｐｏｒｉｎ－２．ＭｅｔｈｏｄｓＮｉｎｅｔｅｅｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｈｏｕｎｄｅｒｔｏｏｋｅｌｅｃｔｉｖｅｏｐｅｒａｔｉｏｎｕｎｄｅｒｇｅｎｅｒａｌａｎｅｓｔｈｅｓｉａｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒＩＡＴ．Ｔｈｅｙｗｅｒｅｅｓｔｉｍａｔｅｄｔｏｌｏｓｅｂｌｏｏｄｏｖｅｒ８００ｍ１．Ｉｆｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｕｓｅｏｆｈｏｒｍｏｎｅａｎｄａｌｋａｌｉｎｉｔｙｄｒｕｇ，ｉｔｗｏｕｌｄｂｅｅｘｃｌｕｄｅｄ．ＦｉｖｅｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓＲＢＣｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｃｅｎｔｒａｌｖｅｎｏｕｓｃａｔｈｅｔｅｒａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｇｒｏｕｐｌｗｅｒｅｐｒｅｓｅｒｖｅｄｗｉｍｔｈｅＣＰＤＡ－ｐｒｅｓｅｒｖｅｄａｔｔｈｅｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．ＩＡＴｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｓａｖｅｒｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｇｒｏｕｐ）．Ｗｅｓｔｏｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇＷａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｏｆｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅＡｑｕａｐｏｒｉｎ－４ＲｅｓｕｌｔＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｄｅｃｒｅａｓｅｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｄｅｃｒｅａｓｅｏｆｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅＡｑｕａｐｏｒｉｎ－４ｏｎｅｏｆｆａｃｔｏｒｓｔｈａｔｍａｋｅｔｈｅｄｅｃｌｉｎｅｉｎｑｕａｌｉｔｙｏｆＩＡＴ．ｓｍｉｃｆｏｒｍ，ｐｏｓｓｉｂｌｅｔｈｅａｕｔｏｂｌｏｏｄｑｕａｌｉｔｙ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＡｑｕａｐｏｒｉｎｓＲｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｔｒａ－ｏｐｅｍｔｉｏｎａｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ論文術(shù)中自體血回輸對紅細(xì)胞膜水通道蛋白－２（ＡＱＰ２）和水通道蛋白－４（ＡＱＰ４）的影響隨著各類高難復(fù)雜放療的舉辦，臨床上對血液的需求越來越多。
因?yàn)檠旱倪^剩及異體輸血可能帶來的并發(fā)癥，術(shù)中自體輸血技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用。術(shù)中自體血回輸（ＩｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅＡｕｔｏｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，ｔａＴ）是指在放療中把術(shù)野的失血搜集處理后回輸給病人的技術(shù)。這些技術(shù)的舉辦解決了稀有血型圍術(shù)期血源短缺的問題。負(fù)壓吸引，抗凝，高速離心及清洗等多個處理過程會對紅細(xì)胞引起一定程度的化學(xué)和物理損傷，影響紅細(xì)胞在體內(nèi)的生物化學(xué)性質(zhì)甚至其攜氧能力。水通道蛋白是存在紅細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)蛋白，功能主要是對水的單向通透，其結(jié)構(gòu)的改變或則其數(shù)目的增減還會影響水分子的通透，從而可以影響紅細(xì)胞的形態(tài)和功能。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ印跡法對術(shù)中自體血的紅細(xì)胞膜的水通道蛋白的抒發(fā)進(jìn)行了研究，借以闡述術(shù)中自體血回輸對紅細(xì)胞膜水通道蛋白（ＡＱＰｓ）的影一、病例選擇臨床資料與方式１、病例選擇選定擬行自體血回收，術(shù)中失血量超過８００毫升的擇期放療患者１９例，其中腦內(nèi)科２例，眼科３例，腎臟內(nèi)科１４例，除外術(shù)中應(yīng)用激素和酸性液體的病例。將同一患者不同時點(diǎn)的血液分為２組。實(shí)驗(yàn)組為自體血組，應(yīng)用自體２０００．型血液回收機(jī)（上海京醫(yī)醫(yī)療設(shè)備公司）回收術(shù)野的血。經(jīng)過搜集，抗凝，過濾，離心，清洗全程血液回收處理（圖１）。
實(shí)驗(yàn)組在血液回收完畢后立刻取尿樣７毫升，２毫升分別做驗(yàn)血和血?dú)馄饰觥φ战M為新血水組，麻醉誘導(dǎo)成功后經(jīng)中心靜脈導(dǎo)管取血５毫升，溫度下放置在盛有ＣＰＤＡ．１保存液中的試管中，待自體血標(biāo)本留置后，將標(biāo)本深高溫保存，直至最后一個標(biāo)本取完。圖１，術(shù)中自體血（ＩＡＴ）回收的處理過程模式圖２、主要儀器和試劑全手動血細(xì)胞剖析儀（ＨＰ．１２５，日本）Ｂａｙｅｒ血?dú)怆娊赓|(zhì)剖析儀（日本）深高溫冰柜（美國）高速冷藏離心機(jī)（Ｓｉｇｍａ３Ｃ１５Ｋ日本）多功能電泳儀（上海五一器廠），紫外分光光度計(jì)（Ｕｖ－３０００，美國凝膠手動成像及剖析系統(tǒng)（ＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ５５００，日本）轉(zhuǎn)運(yùn)電泳槽（上海五一儀器廠）乙酸纖維膜購自英國Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司。兔抗多克隆抗原ＡＱＰ２，ＡＱＰ４（Ｈ－８０），ＳＣ．２０８１２，ｓａｎｔａＣｒｕｚＣＰＤＡ．１保存液（南京萬華生物有限公司）一次性使用血液回收套件（廣州菲拉爾醫(yī)療用具有限公司）３、檢測指標(biāo)驗(yàn)血（白細(xì)胞，紅細(xì)胞和血小板），血?dú)馄饰觯ǎ校戎担獕海蛔泽w血回收處理完畢后立刻行驗(yàn)血和血?dú)馄饰觥Ｋǖ赖鞍椎幕叶戎当嚷省＃祝澹螅簦澹颍钣≯E測量將標(biāo)本從深高溫冰柜取出后，溫度放置熔化，把尿樣反復(fù)離心后，棄堿液，加入０．２毫升細(xì)胞裂解液［１００ｍｍｏｌ／Ｌ嘶ｓ／Ｈｃｌ（ＰＨ７．５），１００ｍｍｏｌ／ＬＮａｃｌ細(xì)胞膜通道，０．５％脫氧膽酸鈉，ｌｍｍｏｌ／Ｌ己二胺四羧酸（ＥＤＴＡ），１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ一４０，０．１％十二羰基氯化鈉ＳＤＳ］提取的細(xì)胞總蛋白樣品經(jīng)Ｌａｒｒｙ法定量，取５ｇ蛋白上樣體到１５％的ＳＤＳ．聚丙烯丙酯凝膠，電泳（１００Ｖ，１．５ｈ）。
待溴酚藍(lán)步入凝膠底片后，用抗ＡＱＰ４和ＡＱＰ２抗原孵育，最后加入用酸性乙酸酶（ＡＰ）標(biāo)記的相應(yīng)二抗，用０－ＤＩＡＮＩＳＩＤＩＮＥ，ＴＥＴＲＡＺＯＴＩＺＥＤ和－ＮＡＰＨＴＨＹＬＡＣＩＤＰＨＯＳＰＨＡＴＥ顯色劑進(jìn)行顯色后，凝膠成像儀剖析。４、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件ＳＰＳＳｌ３．０進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)剖析，組間比較用配對ｔ檢驗(yàn)，Ｐ＜０．０１為差別有明顯性。對Ｗｅｓｔｅｒｎ印跡測量結(jié)果應(yīng)用凝膠圖像剖析系統(tǒng)進(jìn)行灰度剖析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果ｌ、全手動細(xì)胞剖析儀得到的回收后的自體血中白細(xì)胞和血小板顯著降低，如表１，ｐ＜０．０１有明顯差別，而紅細(xì)胞經(jīng)過配對檢驗(yàn)后，沒有差別（Ｐ＞０．０５）。表１，新血水和自體血驗(yàn)血的變化｝差別有明顯性。２、血?dú)馄饰龅玫剑鹤泽w血ＰＨ值顯著下降，與新血水組比，ｐ＜０．０１，有明顯差別。自體血組血壓顯著增長，與新血水組比，ｐ＜０．０１，有明顯差別。見表２表２，新血水和自體血血?dú)馄饰龅模校戎岛脱獕耗静顒e有明顯性。３、Ｗｅｓｔｅｍ印跡測量的結(jié)果１．新血水組；２．自體血組圖２，Ｗｅｓｔｏｎｂｌｏｔ印跡檢查新血水組和自體血組水通道蛋白．２和水通道蛋白－４的抒發(fā)（ｎ＝１９）。
１４０１２０１００８０６０４０２０時間圖３，ＡＱＰ４的灰度值的直方圖１．新血水組；２．自體血組。１２０理１００８０６０４０２０時間圖４，ＡＱＰ２的灰度值的直方圖，１．新血水組；２．自體血組討論術(shù)中自體輸血的血液成份主要是紅細(xì)胞，自體血的驗(yàn)血就可以看出，血小板和白細(xì)胞的數(shù)目顯著降低，紅細(xì)胞的數(shù)目變化不明顯，因此評價(jià)自體血的質(zhì)量主要是評價(jià)紅細(xì)胞的質(zhì)量。當(dāng)回收的紅細(xì)胞不經(jīng)過處理時，會形成一些結(jié)構(gòu)和功能的變化，如紅細(xì)胞由雙凹面結(jié)構(gòu)的圓盤狀轉(zhuǎn)變?yōu)榧渭扒驙睿辜t細(xì)胞在通過內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)容易被吞噬，但是就會喪失攜氧的功能，這種就會減少自體血的質(zhì)量【１１。在回收過程中經(jīng)過負(fù)壓吸引及離心、過濾、生理鹽水的漂洗等一系列的處理過程后，異型紅細(xì)胞及其大量碎片被清理，得到的回收自體血紅細(xì)胞的形態(tài)在普通光鏡下顯著改觀，但是有一些紅細(xì)胞即使在結(jié)構(gòu)上完整，普通光學(xué)顯微鏡不能１０判定其變化，但其功能早已發(fā)生了變化，回輸?shù)襟w內(nèi)后攜氧能力下滑，參與血液循環(huán)時因剪切撓度發(fā)生破碎，釋放流血紅蛋白而對心臟導(dǎo)致?lián)p害。因而會影響到回收自體血的質(zhì)量。目前國外外關(guān)于回收血紅細(xì)胞質(zhì)量的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)多側(cè)重于測量紅細(xì)胞ＡＴＰ酶、葡萄糖．６．乙酸酶活性、紅細(xì)胞ＡＴＰ濃度、紅細(xì)胞延性、對凝血功能的影響以及對紅細(xì)胞的免疫等等，以回收血紅細(xì)胞功能的研究為主【７’９】，對紅細(xì)胞膜的基本結(jié)構(gòu)．水通道蛋白（ＡＱＰＳ）的研究尚未見到。
水通道蛋白（ＡＱＰＳ）是一種高度通透水份子的蛋白，是１９８８年Ａｇｒｅ等【ｌＯｌ對紅細(xì)胞膜分離，純化Ｒｈ氨基酸時發(fā)覺了一個２８ＫＤ的疏水跨膜蛋白，１９９１年完成了其ｃＤＮＡ克隆［２１，次年進(jìn)行了功能鑒赳３１。Ａｇｒｅ００１等的研究表明，單個水通道具有特別強(qiáng)的單向通透水份子的能力，通透速率為（１００．２００）ｘ１０．６ｍ．Ｓ．１ｔ４－６】，這種私密性可以達(dá)到脂類雙分子層的１０到１００倍，私密性受滲透壓、ＰＨ值、激素等的調(diào)節(jié)。水通道蛋白（ＡＱＰｓ）最初發(fā)覺是在紅細(xì)胞膜上，證明其對水的高通透功能也是通過紅細(xì)胞膜得出推論的。水通道蛋白（ＡＱＰｓ）是一個家族，至今發(fā)覺１２個成員，依據(jù)其基因結(jié)構(gòu)和序列同源程度，該家族成員可分為３組，其中ＡＱＰ０、