細胞膜蛋白質的提取劉筱茜、葉爾江、王瑤琪、王國旭、趙昕毓01細胞膜及膜蛋白介紹02細胞破碎及純化方式03蛋白質提取分離方式04收獲與展望01細胞膜及膜蛋白介紹02細胞破碎及純化方式03蛋白質提取分離方式04收獲與展望1.1細胞膜介紹1）細胞膜結構第一章細胞膜及膜蛋白介紹1.1細胞膜介紹2）細胞膜功能第一章細胞膜及膜蛋白介紹1.2膜蛋白介紹1）分類第一章細胞膜及膜蛋白介紹1.2膜蛋白介紹2）膜蛋白特性外在膜蛋白通常為水溶性蛋白，主要靠離子鍵或其他較弱的物理鍵與膜表面的蛋白質分子或脂分子結合，結合不緊密。內在蛋白多數為跨膜蛋白，通過自身的跨膜結構域與磷脂雙分子層的疏水核心互相作用（跨膜結構域兩端的帶電荷的多肽殘基與磷脂極性背部互相作用),因而結合十分緊密。第一章細胞膜及膜蛋白介紹1.2膜蛋白介紹3）膜蛋白為何如此重要？參與和調節細胞的各類代謝活動細胞與外界環境進行物質交換、能量轉移和訊號傳遞的橋梁可產生通道、載體,對離子和一些可溶代謝物進行選擇性轉運參與細胞辨識和訊號轉導,形成相應的生物學效應超過半數以上的己知膜蛋白被預測是抗生素作用靶向第一章細胞膜及膜蛋白介紹1.2膜蛋白介紹4）膜蛋白分離難點疏水性強分子量大相對可溶蛋白產率較低易形成沉淀、丟失第一章細胞膜及膜蛋白介紹01細胞膜及膜蛋白介紹02細胞破碎及純化方式03蛋白質提取分離方式04收獲與展望2.1細胞破碎方式1）方式分類機械破碎法（碾磨法、組織磨碎法、超聲波法、壓榨法、凍溶法）縮聚和自溶法物理處理法生物酶解法反復凍融法低滲裂解法依照研究對象細胞膜的硬度確定破碎方式第二章細胞膜破碎及純化方式2.1細胞破碎技巧2）超聲破碎法借助超聲波振蕩器發射的15-25kHz的超聲波探頭處理細胞飄浮液，使細胞破碎。
膜收獲率高，而且操作較為復雜，但是可能破壞細胞膜完整性。用超聲波和碾磨法對耐熱耐堿性細胞株DG6的破碎情況進行了比較，研究發覺超聲破碎法可完全破碎細胞成大小不同的顆粒，而加入碳化硅碾磨法得到的細胞顆粒大小較均一，但是保留了細胞膜的完整性。第二章細胞破碎及純化方式2.1細胞破碎方式3）凍融破碎法and細胞置于高溫下冷藏（約-15℃），然后在溫度中融化，重覆多次而達到破壁作用。因為冷藏，一方面能使細胞膜的疏水鍵結構斷裂，因而降低細胞的親水性能，另一方面胞內水結晶，產生冰碳化物，導致細胞膨脹而斷裂。等采用凍融與勻漿結合的方式將細胞破碎，并采用染色法進行跟蹤測量，可使細胞膜斷裂而細胞核未斷裂。第二章細胞破碎及純化方式2.1細胞破碎方式4）低滲裂解法（low-lytic）借助滲透壓的作用，胞外的水迅速溶入胞內，造成細胞快速膨脹而斷裂的方式。第二章細胞破碎及純化方式2.1細胞破碎方式5）酶溶破碎法（lysis）借助溶化細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁遭到部份或完全破壞后細胞膜蛋白，再借助滲透壓沖擊等方式破壞細胞膜，進一步減小胞內產物的私密性。
溶菌酶（）適用于革蘭氏陰性菌細胞的分解，應用于革蘭氏陽性菌時細胞膜蛋白，需輔以EDTA使之更有效地作用于細胞壁。真核細胞的細胞壁不同于原核細胞，需采用不同的酶則處理較溫和。第二章細胞破碎及純化方式2.2細胞膜純化方式1）細胞膜純化細胞經破膜后粗質膜的制備常采用二級離心法,即首先低速離心將未破的細胞、線粒體、細胞核等沉淀,之后高速離心得到膜性成份。進一步純化方式主要有電泳分離法、密度梯度離心法以及雙水相萃取等方式。第二章細胞破碎及純化方式2.2細胞膜純化方式2）電泳分離法依照質膜與其它碎片所帶電荷量不同進行分離。第二章細胞破碎及純化方式2.2細胞膜純化方式3）密度梯度離心法乳腺、睪丸、肝、淋巴細胞和纖維原細胞等多種組織細胞膜的制備均采用了密度梯度離心的方式。要想得到純的細胞膜,非常是將質膜與亞細胞器膜分離,僅采用梯度離心的方式是難以完成的。第二章細胞破碎及純化方式2.2細胞膜純化方式4）雙水相萃取法概念：借助物質在互不相溶的兩水相間分配系數的差別來進行萃取的方式。雙水相體系：將兩種不同的水溶性聚合物的水堿液混和時當聚合物含量達到一定值，體系會自然的分成互不相溶的兩相，這就是雙水相體系。
產生緣由：因為共聚物之間的不相胺類，即共聚物分子的空間制約作用，互相難以滲透，不能產生均一相，因而具有分離傾向，在一定條件下即可分為二相。第二章細胞破碎及純化方式2.2細胞膜純化方式優點缺點1.萃取操作條件溫和2.產品活性損失少3.萃取體系具有較好的可調性4.設備投資小，操作簡單5.含水量高6.便于放大1.雙水相系統含較高含量的水溶性聚合物和鹽，會帶到產物中2.水溶性聚合物和鹽借助率低3.通常只用于粗分離4）雙水相萃取法常用的雙水相體系1.共聚物/共聚物體系：聚乙二醇(簡稱PEG)/葡聚糖(簡稱)。2.共聚物/無機鹽體系為:PEG/鹽酸鹽或乙酸鹽體系。第二章細胞破碎及純化方式01細胞膜及膜蛋白介紹02細胞破碎及純化方式03蛋白質提取分離方式04收獲與展望3.1表面活性劑提取法1）常用表面活性劑目的：增溶。類型：可分為離子型、非離子型和兩性表面活性劑,處理膜蛋白質時可產生去污劑-蛋白質混和體系。助溶機理：（1）增溶機理（2）置換機理第三章蛋白質提取分離方式3.1表面活性劑提取法去垢劑的選擇原則通常去垢劑分離膜蛋白時,須要考慮去垢劑的溶化能力和溫和性。
強離子去垢劑，如SDS，盡管具有挺好的溶化性能，但容易導致蛋白質變性；弱離子型或非離子型去垢劑對蛋白變性影響較小,但溶化能力較差。第三章蛋白質提取分離方式3.2試劑盒提取法1）提取原理裂解細胞后，先離心分離出質膜粗提物，再借助特殊的抽提，選擇性地分離提取膜蛋白。抽提含一種特殊的去污劑，在4℃時所有的蛋白質均可都溶于抽提，但在37℃時，抽提分為水相和去污相；此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中，根椐該性質分離出膜蛋白。提取方式簡單，可靠，快速。第三章蛋白質提取分離方式3.2試劑盒提取法2）試劑盒的組成40ml150ml22.0mlTM-PEKA2.0mlTM-PEKB0.4mlSetIII（存儲：六個月以內可置于4度保存，常年儲存在零下二十度下，使用之前置于溫度下）第三章蛋白質提取分離方式3.2試劑盒提取法3）試劑盒的使用方式細胞或均漿組織用1溶化并通過離心使胞質可溶性部份與不可溶性的膜部份進行分離。
用2A或2B將膜蛋白從脂類單層分離。或2B提早用提取稀釋TM-PEKA或則B。作用比較緩和，可以回收一些易碎蛋白的復合體。是一種高效的提取試劑，有利于回收一些無法提取的膜蛋白。第三章蛋白質提取分離方式3.2試劑盒提取法4）試劑盒的使用步驟制備緩沖液2A，2B。從培養瓶中倒掉原氨水。用PBS于4℃洗滌細胞兩次。加入3mL的PBS到培養容器中并轉移細胞到15ml錐形管中。離心后漂浮細胞于1ml提取緩沖液1+10下挫蛋白酶抑制劑III中。在4℃下孵育10分鐘并輕輕攪拌以防止產生細胞結節。.離心后取出堿液并儲存在冰中，分離出可溶蛋白質。重新漂浮于0.2ml提取液2A+5下挫蛋白酶抑制劑III或0.2毫升提取液2B+5下挫蛋白酶抑制劑組III中。溫度下孵育45分鐘并輕輕攪拌。（降低溫育時間可以降低蛋白質回收，但可能會造成減少靶蛋白的活性。反之，孵育在高溫（4℃）可以更好地保存的活性，但可能會增加萃取效率。離心后將濾液轉移至新管，得到整合膜蛋白。
第三章蛋白質提取分離方式01細胞膜及膜蛋白介紹02細胞破碎及純化方式03蛋白質提取分離方式04收獲與展望4.0收獲與展望1）雙水相萃取的應用去污劑/聚合物雙水相體系結合了去污劑對膜蛋白的增溶作用及成相物質含量低的特性,用于低含量、痕量成分的分離檢查,保證生物活性物質在其中分配不易失活變性,有望成為膜蛋白分離純化的熱點。第四章收獲與展望4.0收獲與展望2）模擬研究的新技術??等人研制出一種脂類納米圓盤來取代細胞膜上磷脂單層膜，讓被純化下來的細胞膜蛋白還能與通常細胞膜蛋白一樣行使其正常功能。這些納米圓盤的結構如同通常細胞膜一樣，由兩層背對背的磷脂所組成，為了使納米圓盤表面保持平坦，其研究小組模仿制做臺灣拉面的形式，將其純化下來的膜蛋白當作餡兒，將其磷脂當成肉松包裝紙，使磷脂緊密圍繞在膜蛋白周圍。??第四章收獲與展望參考文獻[1]陳海霞，耿美玉，管華詩.細胞膜糖蛋白及其多糖鏈剖析方式的研究進展[J].中國生物工程刊物，2003,23(3)：20-24.[2]顏建華.去污劑與膜蛋白的提取[J].美國醫學臨床生物物理與檢驗學分冊，1993,14(4)：162-164.[3]劉娟，朱建航，范杰平.去污劑/聚合物雙水相體系在膜蛋白分離中的應用[J].四川科學，2008,26(3)：416-420.[4]胡銳.質譜聯用技術研究細胞膜結構[D].上海：華東科技學院.2012.[5]周斌，劉曉東，王鳳鵑，劉珂，陳溥言.PK-15細胞膜蛋白提取方式的比較及豬瘟病毒膜表面受體的初步鑒別[J].畜牧與獸醫，2011,43(5):1-4.[6]Zhi-jianTan,Fen-fangLi,Xue-leiXu,Jian-minfú.andofaloeandusingionicbasedtwo-phasewith[J].,286(2012):389–393.[7]TheofKit..[8]JiaxiWang,Gao,Yan,Zhang.Anandin-situbased-forandofanditsintips[J].Acta.880(2015):77–83.感謝！覺得這個地方可以全中文弄起來~