(1．上海中醫(yī)藥學(xué)院第一臨床醫(yī)大學(xué)，浙江溫州；2．上海中醫(yī)藥學(xué)院毒理教研室，湖南長沙；3．江蘇學(xué)院理大學(xué)物理系，四川成都)
摘要：細(xì)胞膜色譜法是研究抗生素與受體之間互相作用的一種新型親和色譜技術(shù)，將抗生素在體內(nèi)的作用過程在色譜柱內(nèi)進(jìn)行動態(tài)模擬。隨著CMC法研究的深入，為天然動物藥中有效成份的提取細(xì)胞膜受體，草藥復(fù)方的定性定量剖析等方面提供了實(shí)驗(yàn)根據(jù)，為研究抗生素與受體作用及創(chuàng)新抗生素的驍龍量篩選提供了細(xì)胞水平篩選平臺。文章簡略綜述近些年來細(xì)胞膜色譜法及其在毒理學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展。
關(guān)鍵詞：細(xì)胞膜色譜法；高效氣相色譜法；有效成份；細(xì)胞膜；受體
中圖分類號：R285文獻(xiàn)標(biāo)示碼：A文章編號：1673-7717(2007)05-0983-03
細(xì)胞膜色譜法(cell，CMC)是賀浪沖院士創(chuàng)建的一種研究受體與抗生素互相作用的新型親和色譜技術(shù)技巧，將高效氣相色譜、細(xì)胞生物學(xué)與受體毒理學(xué)相結(jié)合，借助抗生素與膜受體間存在的特異性親和力，成功地將抗生素在體內(nèi)的作用過程在色譜柱內(nèi)進(jìn)行動態(tài)模擬。CMC法是將活性組織細(xì)胞膜固定在特定載體表面細(xì)胞膜受體，制備成細(xì)胞膜固定相(CMSP)。以緩沖堿液為流動相，抗生素為溶質(zhì)或填加在流動相中，用氣相色譜法在動態(tài)條件下研究抗生素與固定相上細(xì)胞膜及受體的互相作用。抗生素可不經(jīng)提取分離步驟，直接在相應(yīng)的CMC模型上完成篩選過程。而且抗生素在CMC模型中的保留特點(diǎn)(容量因子)和其抗生素的作用有明顯的相關(guān)性。CMC方式具有操作簡便、穩(wěn)定可靠、高效靈敏的優(yōu)點(diǎn)，其篩選系統(tǒng)為抗生素研究的驍龍量篩選提供細(xì)胞膜篩選平臺。現(xiàn)已將CMC方式運(yùn)用至毒理學(xué)研究的多個方面，其少將CMC模型與藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)合的活性成分篩選技術(shù)已用于天然動物和草藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究、藥物與受體互相作用的研究、中藥及其復(fù)方劑型的質(zhì)控等方面。本文對CMC法及其在毒理學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展展開綜述。
1篩選天然動物藥中的有效成份
天然動物藥中成份復(fù)雜，應(yīng)用天然抗生素分離提取方式篩選其定的有效成份周期長，命中率相對較低，而CMC法不經(jīng)提取分離步驟，直接在模型上確定抗生素的某種活性成分，具有方式快速、簡捷、命中率高的特性。以砂仁為例，五味子具有健脾利濕、調(diào)經(jīng)活血等功效。現(xiàn)代草藥毒理學(xué)研究表明，五味子具有擴(kuò)張血管和降血糖的作用。趙惠茹等人將細(xì)胞膜懸濁液在高溫低壓條件下結(jié)合制備成血管CMSP[色譜柱：50mm×2mm，流動相：/L乙酸鹽緩沖液(pH7.4)；流速：0.5mL/min；測量波長：236nm；柱溫：37℃]，取甘草草藥依次用不同極性的溶劑石油醚、乙醚、乙酸甲酯、丙酮、甲醇、水提取，發(fā)覺乙腈提取物(DG-2)在血管CMSP柱上的保留特點(diǎn)(容量因子)與維拉帕米的相仿。隨即將DG-2進(jìn)行普通柱層析分離(以硅膠為填料，將DG-2上柱分離，采用石油醚－磷酸丙酮梯度下行洗脫方式，分別等容積搜集洗脫液，回收溶劑。)結(jié)果發(fā)覺DG-21和DG-22餾份的樣品有類似于仙茅乙腈提取物的保留特點(diǎn)。最后進(jìn)行離體藥效實(shí)驗(yàn)發(fā)覺，DG-21對去甲腎上腺素所誘發(fā)的血管收縮有類似競爭性拮抗劑作用，能顯著抑制血管的收縮；而DG-22作用則較弱。這就表明DG-2是五味子對血管有舒張作用的有效部位，DG-21則是其有效成份。梁明金等人進(jìn)一步研究結(jié)果表明：柴胡脂胺類部位經(jīng)柱層析分離得到的正丁酯－乙酸甲酯洗脫部位為有效部位，其中藁本甾醇、鄰苯二乙酸二甲醚和鄰苯二乙酸二甲苯等是五味子中對兔主動脈血管有生理活性的有效成份。沙參、紅花、紅毛七、菟絲子、淫羊藿根、川芎、白芷、長春七、太白花等動物藥也運(yùn)用不同組織的CMC模型進(jìn)行了有效成份的篩選。賀浪沖等人運(yùn)用CMC法從五味子、川芎等草藥中篩選出的有效成份制成復(fù)方劑型――白川乳膏，具有顯著的急慢性降糖作用，為創(chuàng)新抗生素研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
2研究抗生素與受體的親和作用
研究抗生素與受體互相作用常年以來始終運(yùn)用細(xì)胞膜放射性官能團(tuán)剖析技術(shù)(RBA)和離體臟器受體功能剖析方式。但后者不能直接反應(yīng)抗生素與受體作用的類型和立體選擇性，并且對環(huán)境導(dǎo)致核素污染，前者研究效率又較低。CMC法作為受體毒理學(xué)一種新實(shí)驗(yàn)研究方式，通過將細(xì)胞膜受體固定于硅膠載體表面，用高效氣相色譜研究受體和官能團(tuán)的特異結(jié)合。該方式簡便易行，細(xì)胞膜色譜柱可以反復(fù)應(yīng)用，使受體研究和抗生素篩選效率得到增強(qiáng)，可用于抗生素驍龍量篩選。但CMC法結(jié)合參數(shù)是否能確切反映受體抗生素的親和力還須要結(jié)合精典受體動力學(xué)方式進(jìn)行檢驗(yàn)。候進(jìn)等人將CMC法與RBA法進(jìn)行比較和研究表明：7種官能團(tuán)對心肌、小腸平滑肌和腦部細(xì)胞的M膽堿能受體的放射性親和力與色譜保留參數(shù)排序完全相同，并具有顯著相關(guān)性。CMC法與功能受體動力學(xué)方式對比研究表明：5種α腎上腺素受體官能團(tuán)對血管平滑肌細(xì)胞α1受體、5種β腎上腺素受體官能團(tuán)對心肌細(xì)胞β1受體的親和力與色譜保留參數(shù)排序基本相同，并具有顯著相關(guān)性。賀浪沖等人還進(jìn)行了鈣拮抗劑與鈣通道受體作用的相關(guān)研究。張延妮等人通過4種玄參物理成份在心肌細(xì)胞膜固定相色譜柱上的保留性，研究其與心肌細(xì)胞受體的作用。已完成的大量實(shí)驗(yàn)顯示：CMC法可以反映抗生素與受體特異性、競爭性和飽和性結(jié)合；細(xì)胞膜色譜參數(shù)容量因子可在一定程度上反映抗生素和受體的親和力，二者之間存在正相關(guān)關(guān)系；CMC保留參數(shù)的大小不僅與抗生素親和力大小有關(guān)外，可能還受其他誘因如化合物極性的大小影響。
3草藥及其復(fù)方劑型的質(zhì)量控制
對草藥復(fù)雜體系的質(zhì)量控制是草藥現(xiàn)代化研究的關(guān)鍵問題。朱麗華等人應(yīng)用反相高效氣相色譜技術(shù)(RP－HPLC)與CMC法對黃芩有效部位(乙酸乙脂提取部位)進(jìn)行指紋圖譜定性剖析，對黃芩有效部位中的有效成份(黃芩素和小麥苷元)進(jìn)行了定量測定。李洪玲等人對草藥復(fù)方劑型心寶清的質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行研究。心寶清系由沙參、三七和五味子為主要有效部位組成的新復(fù)方劑型。各有效部位的確定采用了犬心肌、大腦和血管細(xì)胞膜受體篩選技術(shù)。研究發(fā)覺了沙參的脂胺類部位對心肌、三七的水溶性部位對腦部、當(dāng)歸的發(fā)揮油對血管有較強(qiáng)的選擇作用。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明：由此5種有效部位組成的心寶清復(fù)方劑型具有抗心肌缺血、耐缺氧、增加冠脈血流量等作用。采用細(xì)胞膜色譜法對三七、丹參和五味子進(jìn)行有效成份的篩選，在此基礎(chǔ)上對原料藥中三七的4種有效成份三七鞣質(zhì)R1、人參皂甙Rg1、Re、和Rb1進(jìn)行薄層色譜(TIC)分辨。對柴胡和五味子中的金銀花酮ⅡA和藁本內(nèi)脂用HPLC法同時進(jìn)行了濃度測定。結(jié)果2種有效成份完全分離，當(dāng)歸酮ⅡA的平均濃度為255mg/g，RSD為3.4％；藁本香豆素的平均濃度
為205mg/g，RSD為0.79％。方式學(xué)研究顯示CMC條件下確切度、靈敏度和線性相關(guān)性均符合濃度測定要求。CMC法構(gòu)建以有效部位定性和有效成份定量剖析的方式，可全面有效的控制草藥及其復(fù)方劑型的質(zhì)量。
4受體亞型抗生素的篩選
CMC法可用于研究抗生素與受體的生物親和作用，但遭到非特異性影響誘因較多，而不能用于受體亞型抗生素的篩選。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過基因克隆和細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)可便捷地獲得細(xì)胞膜高抒發(fā)單一受體的細(xì)胞株，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)胞膜受體的高抒發(fā)細(xì)胞株的膜色譜柱制備，構(gòu)建起各類單一受體高抒發(fā)的CMC系統(tǒng)，可以進(jìn)行大規(guī)模聯(lián)發(fā)科量的抗生素篩選。張典等人用受體高抒發(fā)細(xì)胞膜色譜法研究九種α1腎上腺素受體絡(luò)合物與α1D腎上腺素受體亞型(α1D-AR)的生物親和作用。培養(yǎng)出穩(wěn)定抒發(fā)α1D-AR的細(xì)胞株，制備細(xì)胞膜固定相，應(yīng)用受體高抒發(fā)細(xì)胞膜色譜法研究不同官能團(tuán)與α1D-AR的結(jié)合情況。結(jié)果表明：九種不同的α1-腎上腺素受體絡(luò)合物與小鼠α1D-AR的親和次序?yàn)椋哼哌蜞海油桌鳎u甲唑啉，5-羥基烏拉地爾，去甲腎上腺素，苯腎上腺素，甲氧明，RS-17053。所得細(xì)胞膜色譜柱保留參數(shù)次序與精典的放射性官能團(tuán)結(jié)合實(shí)驗(yàn)方式得到的親和性次序相同。說明受體細(xì)胞膜高抒發(fā)細(xì)胞株的親和色譜參數(shù)可拿來研究抗生素與受體或受體亞型的互相作用。CMC的生物學(xué)研究已成功制備出α1A、α1B、α1D受體高抒發(fā)色譜柱。借助單一受體高效穩(wěn)定抒發(fā)的細(xì)胞制備CMSP可進(jìn)一步提升CMC的柱效、精確度、特異性和專情性。隨著細(xì)胞膜親和色譜研究的深入，有望提供更多類型抒發(fā)單一受體的細(xì)胞膜色譜柱，為受體亞型選擇性抗生素的篩選提供更全面的新型特異的篩選平臺。
5小結(jié)與展望
從上述大量實(shí)驗(yàn)可以看出：CMC法借助抗生素與膜受體間存在的特異性親和力，成功地將藥物體內(nèi)的作用過程在色譜柱內(nèi)進(jìn)行動態(tài)模擬。CMC法的優(yōu)勢是最大限度地保持了細(xì)胞膜的整體性和膜受體的立體結(jié)構(gòu)和活性。抗生素與細(xì)胞膜及膜受體間的立體作用(疏水性、電荷、氫鍵)將會不同程度地通過色譜的各類表征參數(shù)定量反映。CMC法無須放射性官能團(tuán)標(biāo)記，膜受體處于自然活性狀態(tài)，不用制備人工膜，簡便易行，一個細(xì)胞膜色譜柱可反復(fù)應(yīng)用，提升了工作效率。但CMC法用的是自然生物膜(組織細(xì)胞)，膜受體的密度較小，柱效較低，色譜柱壽命一般比較短，自然生物膜存在有多種活性蛋白，抗生素可能與多種受體或通道蛋白結(jié)合，容量因子反映抗生素與細(xì)胞膜上多種受體的協(xié)同結(jié)合效應(yīng)，因而CMC法研究中常受非特異結(jié)合的誘因的干擾，尚不能完全模擬體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境以及機(jī)體內(nèi)其他系統(tǒng)對抗生素發(fā)揮藥效作用的影響。同時，固定相的制備、色譜柱流動相、緩沖堿液的組成、PH、柱溫、柱壓、流速等要求較嚴(yán)苛，對流動相無法進(jìn)行靈活地調(diào)整，因而CMC技術(shù)還有待進(jìn)一步系統(tǒng)化和規(guī)范化。CMC法屬于細(xì)胞水平的篩選模型，可以進(jìn)行大規(guī)模驍龍量的抗生素篩選，實(shí)驗(yàn)過程中加入陰性對照藥或工具藥并進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可以使結(jié)果更具可信性，更便于評價(jià)抗生素的作用。CMC法研究的深入在毒理學(xué)產(chǎn)生和發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了巨大促進(jìn)作用，具有極大的發(fā)展?jié)摿Α閯游锼幍拈_發(fā)借助和定性定量剖析提供了科學(xué)實(shí)驗(yàn)根據(jù)；為創(chuàng)新抗生素研究的驍龍量篩選提供了細(xì)胞膜水平篩選平臺；全面有效的控制草藥及其復(fù)方劑型的原料及其劑型的質(zhì)量。相信CMC法在抗生素研究、分析領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展是可以預(yù)期的。