【摘要】：目的:初步觀察不同鈦表面小鼠成骨細胞膜片的成骨效應,以期剖析細胞膜片骨組織工程技術與鈦表面改性的聯合運用是否能對鈦養殖體骨整合界面的產生具有顯著的推動作用。方式:取24h新生SD小鼠頭顱體外分離、提取原代細胞,培養傳至第3代,定期觀察細胞形態并通過蘇木精—伊紅(-eosin,HE)染色、堿性乙酸酶(,ALP)染色、茜素紅(red,ARS)染色、I型膠原免疫組化染色鑒別成骨細胞。靜態水接觸角測試不同鈦表面潤濕性;電鏡掃面(SEM)觀察不同鈦表面形貌特點及負載細胞后生長特點;再將已鑒別的第三代成骨細胞以0./ml密度接種于不同表面鈦片上制備成骨細胞膜片,定期觀察膜片形態并采用ALP活性測試膜片分化;通過實時螢光定量PCR(RT-qPCR)及免疫蛋白印記法()測量OPN,OPG,RANKL成骨標志性因子基因及蛋白的抒發水平;將體外培養14天的成骨細胞膜片植入裸鼠皮下,分別于術后第8周、16周取出植入物行HE染色、染色和I型膠原免疫組化染色,評價在不同鈦表面成骨細胞膜片體內異位成骨的能力。
結果:原代細胞經培養及鑒別,細胞形態學復合成骨細胞特點;三種鈦表面靜態水接觸角均呈小于5°,大于90°,呈親水性表面(大于5°為超親水性,小于90°為疏水性,介于5°-90°之間為親水性),實驗組較對照組更接近超親水性,而實驗組之間比較無明顯差別(P0.05);電鏡掃描顯示機械拋光組表面較光滑,成骨細胞附著生長不連續,基質銜接有破裂且多為雙層生長;陽極氧化組表面產生較為整齊均勻的多孔陣列結構,細胞生長密集有序,基質延孔邊沿聯接、爬行;噴丸酸蝕組表面產生“蜂窩狀”多級多孔,凸凹不平,細胞黏附后呈三維方向疊層生長;ALP檢查,各時間點,實驗組活性均低于對照組(P0.05),實驗組之間ALP活性抒發無明顯差別(P0.05);各組成骨細胞膜片在第14天ALP活性均高于第7天(P0.05)。RT-qPCR及blot檢查:組間比較,實驗組中細胞膜片OPN、OPGmRNA和蛋白的抒發量在各時間點均低于對照組(P0.05),實驗組之間比較在各時間點均無明顯差別(P0.05);組內比較,實驗組及對照組OPN、OPGmRNA和蛋白從第7天到第14天呈下調趨勢(實驗組及對照組和蛋白:P0.05,對照組OPGmRNA及蛋白:P0.05,實驗組OPGmRNA及蛋白:P0.05);不同鈦表面對RANKLmRNA及蛋白的抒發沒有明顯影響(P0.05)。
體內異位成骨實驗染色結果顯示細胞膜片,在第8周對照組無法產生骨樣基質,實驗組均能產生骨樣基質,但實驗組間差別不顯著;第16周,三組均能產生類骨樣組織,可見成骨組織相關結構,相比對照組,實驗組形態及成熟度相對更佳,實驗組之間比較,綜合三種染色剖析,陽極氧化組及噴丸酸蝕組產生骨組織無顯著差別。推論:(1)相比機械拋光表面細胞膜片,小鼠成骨細胞膜片在陽極氧化及噴丸酸蝕鈦表面具有更佳的成骨效應,陽極氧化與噴丸酸蝕組間差別無明顯性。(2)鈦表面小鼠成骨細胞膜片成骨效應的調控可能主要通過影響OPG的抒發來實現,對RANKL的影響不明顯。(3)陽極氧化及噴丸酸蝕表面成骨細胞膜片在8周時可見骨樣基質產生,機械拋光組膜片未見骨樣基質,在16周后均能在體內產生骨組織。
