本發明涉及細胞工程學技術領域，具體涉及一種細胞膜功能化修飾技巧。
背景技術：
細胞膜是真核細胞的重要組成部份，它不但與細胞的分裂，增殖，遷移及壞死等息息相關，還在細胞與外部環境發生物質、能量交換中發揮重要作用。同時，細胞膜能夠調節細胞-細胞互相作用，細胞-細胞通信和細胞內訊號傳導途徑。因而，對細胞膜進行功能化修飾，有利于推動基礎細胞生物學研究，調控細胞間互相作用，操縱細胞訊號轉導等。目前，已有大量的功能材料被修飾到細胞膜上，如dna，氨基酸，高分子材料等。在這種材料中，dna因其便于合成，結構可預測，可編程性強等優點而被廣泛應用。目前常用的細胞膜修飾方式有：1.基于基因工程的技巧。該方式通過向細胞內導出新的基因，從而在細胞膜上持續抒發功能蛋白，進而實現細胞膜的功能化修飾。但是，這些方式不但操作復雜、耗時，并且可能會導致基因組成分的改變，給細胞研究帶來不可預測的影響。2.基于靜電吸附的技巧。細胞的膜表面帶負電荷，它可以通過靜電作用吸附帶正電的材料(如聚乙烯吡啶(pei)、多聚賴谷氨酸(pll)等)，實現細胞膜的快速修飾。但是，這種帶正電的高分子聚合物一般具有較高的細胞毒性，但是其在細胞膜表面的穩定性遭到培養基離子硬度的影響(靜電屏蔽作用)，限制了其實際應用范圍。3.基于細胞代謝的方式。
該方式利用人工合成的糖代謝前體將物理標簽(如，疊氮官能團)整合到細胞膜表面糖基化蛋白上。借助溫和的點擊物理反應，將帶有炔基標記的探針修飾到細胞膜上。這些方式繁雜歷時，通常須要2-3天的代謝標記時間細胞膜蛋白，未能實現細胞膜的快速修飾。4.基于共價交聯的技巧。細胞膜表面抒發大量的蛋白質分子，這種蛋白質中富含大量的甲基，乙基等活性羧基。通過酰基與琥珀酰吡啶酯(nhs)、巰基與馬來酰吡啶酯(mal)等反應，將探針共價修飾到細胞膜表面。但該方式具有反應效率低，且涉及有機物理反應，可能形成較強的細胞毒性乃至影響細胞正常的生理功能。5.基于疏水端插入細胞膜的技巧。磷脂雙分子層是細胞膜的主要組成成份之一，其兩端具有親水性，而中間部份具有疏水性。兩親性探針可以借助其疏水端與磷脂雙分子層之間的相像相溶性質，自發錨定到細胞表面上。此方式因為具有快速高效、普適性強、生物兼容性好等優點，遭到了廣泛關注。但是，目前通過這些方式修飾的探針在細胞膜上的穩定性較差，在復雜生物體系(如，富含血漿的培養基)中容易從細胞膜表面開裂。據悉修飾在膜表面的探針容易與其他成份發生非特異性互相作用，增加了探針的靶標辨識能力。
技術實現要素：
本發明的目的是借助dna納米技術，建立兩親性dna多面體探針，開發一種新型的細胞膜修飾技巧。該方式不但能將探針分子快速、高效、無損地修飾到細胞膜上，就能明顯提升探針在細胞膜上的穩定性及其分子辨識性能。據悉，基于dna納米結構的可編程性，該方式可實現多種功能模塊在細胞膜的高效自組裝，為細胞分子生物學、組織工程及基于細胞的診治等領域的研究提供了新技術。
本發明的目的是通過以下方法實現的：
一種細胞膜的功能化修飾方式，通過dna多面體上修飾的疏水分子的疏水作用將其插入到細胞膜磷脂雙分子層，因而實現多面體在細胞膜表面的錨定，在dna多面體沒有修飾疏水分子的頂點延展出dna序列，或則通過延展出的dna序列與其它功能單元結合完成細胞膜的功能化修飾。
所述的細胞膜的功能化修飾方式，dna多面體探針具有四個頂點，其中三個頂點均修飾有疏水分子。
所述的細胞膜的功能化修飾方式，疏水分子包括：尿酸、二甲基脂類體或生育酚等。
本發明在dna多面體沒有修飾疏水分子的頂點延展出dna序列，可以用于細胞膜上分子特異性辨識。
所述的細胞膜的功能化修飾方式，其他功能單元包括：核苷酸分子，核苷酸適配體、脫氧核酶、小分子、多肽、蛋白或納米顆粒等。小分子包括：抗生素類小分子或發光官能團小分子等，抗生素類小分子包括ce6等。納米顆粒包括：金納米顆粒，磁納米顆粒等。
本發明還可以通過延展出的dna序列與其它功能單元結合，實現各類功能。
例如：
功能單元為核苷酸適配體，其與dna多面體延展出的dna序列互補雜交，可以實現細胞膜特異性辨識及細胞間選擇性團聚。
功能單元為抗生素小分子，與dna多面體延展出的dna共價交聯，可以實現根治等功能。
功能單元為發光官能團小分子，與dna多面體延展出的dna共價交聯，可以實現成像等功能。
所述的細胞膜的功能化修飾方式，合成多面體所需的四條dna鏈，其中s1,s2,s3均被尿酸()修飾；
s1-cho:
-,如.1所示。
s2-cho:
-,如.2所示。
s3-cho:
-,如.3所示。
s4:
；如.4所示，頓號的核苷酸為延展序列。
所述的細胞膜的功能化修飾方式，
探針(即一種核苷酸分子，能特異性辨識并結合抒發在細胞表面的ptk7蛋白，從而與高抒發這些蛋白的細胞進行特異性結合)與s4中頓號核苷酸所示序列(即延展dna序列)互補；探針序列為：
，如.5所示。
上述序列僅僅為一個具體的優選反例，本發明方式中涉及的dna多面體序列不限于上述具體的序列，只要四條序列之間滿足產生dna多面體結構，并且三個頂點均被疏水分子修飾即可。
本發明延展出的dna和與之相連的構成多面體的序列之間設置5-8個隨機核苷酸序列(滿足不影響多面體正常產生的核苷酸，不影響探針辨識功能即可，如5-8個t或a等)更有利于延展出的dna特異性辨識或則結合其他功能單元。
螢光官能團修飾核苷酸的位置只要不影響多面體以及延展序列的功能即可。
所述的細胞膜的功能化修飾方式，合成的多面體探針與細胞膜結合時體系中含量達到優選250nm。
所述的細胞膜的功能化修飾方式，合成的多面體探針與細胞膜結合反應時間優選10分鐘。
本發明技術方案的詳盡闡釋：
1)兩親性dna多面體探針的制備
該dna多面體探針具有四個頂點。其中三個頂點分別修飾一個疏水分子(比如，尿酸分子)，這種疏水分子可通過疏水作用插入到細胞膜磷脂雙分子層，因而實現多面體探針在細胞膜表面的錨定。用第四個頂點延展出一段特定的dna單鏈序列，借助這段dna序列或則通過dna互補雜交引入其他功能單元(比如，核苷酸適配體、脫氧核酶、小分子、多肽、蛋白等)，可用于實現細胞膜表面的分子辨識或生物催化或醫治或成像等功能。多面體經過三個頂點的疏水性處理才能大大降低其在細胞膜表面的結合和穩定性，并且多面體具有良好的剛性及明晰的三維結構，有利于探針分子遠離細胞膜表面并保持有序的空間定向，進而降低探針的靶標辨識能力。同時，探針分子模塊選擇的多樣性促使該方式便于制備一系列具有特定功能的膜錨定探針。
兩親性多面體探針的制備流程如下：將合成多面體所需的四條dna鏈
s1-cho:-,
s2-cho:-,
s3-cho:-,
s4：
。
上述s4序列中粗體顯示的7個t即延展出的dna和與之相連的構成多面體的序列之間設置的隨機核苷酸序列。
將上述序列溶化到pbs緩沖液中(ph＝7.4，鎂離子含量為5mm)，使所有dna鏈條的最終含量均為2μm，之后將該混和濾液在95℃下加熱3分鐘，平緩降至溫度，進而制備獲得兩親性dna多面體探針t-cho3，假如s4的7個t的隨機核苷酸序列中的宋體的核苷酸t進行螢光官能團的修飾，則獲得t-cho3-fam(用于本發明施行例中的t-cho3-fam制備)。
由s1-cho,s2-cho,s3-cho,s4及可制得探針t-cho3-sgc8；
序列為：(制備時體系中的含量2μm)
。
由單個尿酸修飾的單鏈dna分子s-cho1與可制得探針s-cho1-sgc8；
s-cho1序列為：-，如.6所示。
2)表征兩親性多面體探針
2.1)聚丙烯丙酯凝膠電泳表征兩親性多面體探針
用5％聚丙烯丙酯凝膠電泳表征所制備的探針t-cho3。取10μl樣品，加入2μl甘油并充分混和。將混和液加入到5％的聚丙烯丙酯凝膠中，并在110v電流下進行45分鐘電泳實驗。實驗結束后，用顏料對聚丙烯丙酯凝膠染色15分鐘，之后用水清洗兩次，并用凝膠成像儀對樣品成像。如圖1所示，s1-cho,s2-cho,s3-cho和s4反應后挺好的產生了探針t-cho3(泳道7)。
2.2)原子力顯微鏡成像表征兩親性多面體探針
取15μl制備的t-cho3探針，加入5μl含量為300μm的硫酸鎳，在溫度下混和5分鐘。將混和液滴到云母片，并靜置十分鐘。用分餾水將云母片表面清洗三次，并在氫氣氣氛中進行干燥。干燥后的樣品在原子力顯微鏡下進行成像。如圖2所示，原子力成像表明合成的t-cho3探針呈均勻，單分散的顆粒狀，其大小為10納米左右。
3)尿酸修飾數量對多面體探針在細胞膜上穩定性的影響
細胞計數后，取30萬個cem細胞，pbs漂洗一次，并均分為3組，之后分別與250nm的t-cho1-fam(dna序列為與t-cho3-fam相同的多面體，但只修飾一個尿酸)，250nm的t-cho2-fam(dna序列為與t-cho3-fam相同的多面體，但只修飾兩個尿酸)和250nm的本發明方式制備的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分鐘，pbs漂洗一次，分散到富含10％fbs的1640培養基中。三組細胞均在37℃，5％氧氣環境下分別培養0小時，0.5小時，1小時，1.5小時，pbs漂洗一次，共聚焦成像觀察探針開裂情況。如圖3所示，探針t-cho1-fam錨定效率低，且開裂速率快，在半小時內幾乎全部開裂。t-cho2-fam相較于t-cho1-fam錨定效率提高，開裂速率減緩，但仍遠高于t-cho3-fam。
4)t-cho3-fam兩親性多面體探針膜錨定條件優化：
4.1)膜錨定含量優化
細胞計數后，取60萬個cem細胞(人急性淋巴細胞肺癌t淋巴細胞)，pbs漂洗一次，并均分為6組，之后分別與15.6nm,31.2nm,62.5nm,125nm,250nm,500nm的t-cho3-fam探針在4℃下共孵育10分鐘，pbs漂洗一次，流式細胞儀測量。如圖4所示細胞膜蛋白，隨著探針含量的降低，螢光位移顯著降低，當探針含量達到250nm時，探針基本飽和。表明了兩親性多面體探針的高效膜錨定能力。
4.2)膜錨定時間優化
細胞計數后，取60萬個cem細胞，pbs漂洗一次，并均分為6組，之后分別與250nm的t-cho3-fam在4℃下共孵育1分鐘，2分鐘，5分鐘，10分鐘，20分鐘，30分鐘，pbs漂洗一次，流式細胞儀測量。如圖5所示，螢光位移值隨孵育時間降低而降低，到10分鐘基本飽和。表明了兩親性多面體探針能快速錨定到細胞膜。
本發明的有益療效
本發明通過制備兩親性dna多面體探針，發展了一種新型的細胞膜修飾技巧。與傳統的細胞膜修飾方式(如基于基因工程的方式，基于共價交聯的方式及基于細胞糖代謝的方式)相比，該方式能實現快速高效的細胞膜修飾。其修飾時間減短到10分鐘，修飾所需的探針含量也低至250nm。與常規的兩親性探針(如尿酸修飾的單鏈dna探針)相比，兩親性dna多面體探針具有更高的膜穩定性(開裂速率大大增加，內吞效率也顯著減少)。同時，dna多面體探針在細胞膜上的靶標辨識能力也相較于常規的兩親性探針提高3倍。
附圖說明
圖1為聚丙烯丙酯凝膠電泳表征探針的產生。條帶1：s1，條帶2：s1+s2,條帶3:s1+s2+s3,條帶4:s1+s2+s3+s4,條帶5：s-cho1+s2+s3+s4,條帶6：s-cho1+s-cho2+s3+s4,條帶7：s-cho1+s-cho2+s-cho3+s4(t-cho3)。
圖2為原子力顯微鏡成像表征本發明兩親性dna多面體探針的產生；
圖中比列尺代表100nm。
圖3為尿酸修飾數量對多面體探針在細胞膜上穩定性的影響；
(a)為共聚焦表征三種探針膜開裂速率，圖中比列尺代表10μm；
(b)為螢光統計表征三種探針開裂速率。
圖4為流式優化探針膜錨定含量。
圖5為流式優化探針膜錨定時間。
圖6(a)為共聚焦表征兩種探針膜開裂速率，圖中比列尺代表10μm；
(b)為螢光統計表征兩種探針開裂速率。
圖7(a)為共聚焦表征兩種探針的內吞效率，箭頭指示了內吞步入細胞的探針，圖中比列尺代表10μm；
(b)為螢光統計表征兩種探針的內吞效率。
圖8(a)為細胞集聚效率的統計，
(b)為romos細胞膜表面中單條sgc8探針導致的細胞集聚起始速率。
具體施行方法
以下結合施行例借以進一步說明本發明，而非限制本發明。
施行例1：本發明兩親性多面體探針在細胞膜上的穩定性
兩親性多面體探針增加的開裂速率
細胞計數后，取20萬個cem細胞，pbs漂洗一次，并均分為2組，之后分別與250nm的s-cho1-fam(序列為：-//--,代表該處的核苷酸t被螢光官能團修飾)和250nm的本發明方式制備的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分鐘，pbs漂洗一次，分散到富含10％fbs的1640培養基中。兩組細胞均在37℃，5％氧氣環境下分別培養0小時，0.5小時，1小時，1.5小時，pbs漂洗一次，共聚焦成像觀察探針開裂情況。如圖6所示，探針s-cho1-fam在半小時內幾乎全部開裂，而探針t-cho3-fam雖然在1.5小時，也只有不到20％的開裂。闡明了本發明使用的兩親性多面體探針相對于傳統兩親性探針大大增強了在細胞膜上的穩定性。
施行例2：本發明兩親性多面體探針增加的內吞效率
細胞計數后，取20萬個cem細胞，pbs漂洗一次，并均分為2組，之后分別與250nm的s-cho1-fam和250nm的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分鐘，pbs漂洗一次，分散到富含5mm硫酸鎂的pbs中。兩組細胞均在37℃下培養15分鐘，共聚焦成像觀察探針內吞情況。如圖7所示，探針s-cho1-fam在培養15分鐘后，發生了顯著的內吞，而探針t-cho3-fam無顯著內吞。闡明了兩親性多面體探針相對于傳統兩親性探針的大大增強了在細胞膜上的穩定性。
施行例3：本發明兩親性多面體探針在細胞膜上提高靶標辨識能力
細胞計數后，取20萬個ramos細胞，用白色活細胞示蹤劑()在37℃下染色15分鐘,pbs漂洗一次，并均分為2組。之后分別與250nm的t-cho3-sgc8探針和250nm的s-cho1-sgc8探針在4℃下共孵育10分鐘，pbs漂洗一次，分散到富含2％牛血清白蛋白(bsa)的dpbs中。再取200萬個cem細胞，均分為兩組，分別加到上述兩組ramos細胞中，并在溫度下晃動()10分鐘，20分鐘，30分鐘，60分鐘，90分鐘，120分鐘，240分鐘，360分鐘，540分鐘。用共聚焦顯微鏡對不同時間點的樣品進行成像，統計細胞圖團聚效率。如圖8所示，t-cho3-sgc8探針修飾的ramos細胞才能快速辨識cem細胞，并導致高效的細胞團聚(60分鐘后，集聚效率超過了85％)。同時，這些細胞集聚狀態有較高的穩定性，雖然720分鐘后，細胞集聚效率仍高達60％。但是，s-cho1-sgc8探針修飾的ramos細胞對cem細胞的辨識能力較差，在30分鐘時，細胞的集聚效率達到最高峰值(僅約為25％)，此后快速增長，說明了在s-cho1-sgc8探針體系中，細胞集聚狀態的穩定性較差。通過估算romos細胞膜表面中單條sgc8探針導致的細胞集聚起始速率，可以得出t-cho3-sgc8的分子辨識能力要顯著低于s-cho1-sgc8探針3倍。
序列表
青海學院
一種細胞膜的功能化修飾技巧
.0
57
dna
未知()
57
dna
未知()
57
dna
未知()
75
dna
未知()
60
60
dna
未知()
60
28
dna
未知()
技術特點：
技術總結
本發明公開了一種細胞膜的功能化修飾技巧。通過DNA多面體上修飾的疏水分子的疏水作用將其插入到細胞膜磷脂雙分子層，因而實現多面體在細胞膜表面的錨定，在DNA多面體沒有修飾疏水分子的頂點延展出DNA序列，或則通過延展出的DNA序列與其它功能單元結合完成細胞膜的功能化修飾。該方式不但能將探針分子快速、高效、無損地修飾到細胞膜上，就能明顯提升探針在細胞膜上的穩定性及其分子辨識性能。據悉，基于DNA納米結構的可編程性，可實現多種功能模塊在細胞膜的高效自組裝，為細胞分子生物學、組織工程及基于細胞的診治等領域的研究提供了新技術。
技術研制人員：譚蔚泓;邱麗萍;李進
受保護的技術使用者：山東學院
技術研制日：2019.06.11
技術公布日：2019.08.27