本發(fā)明涉及細(xì)胞工程學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞膜功能化修飾技巧。
背景技術(shù)：
細(xì)胞膜是真核細(xì)胞的重要組成部份，它不但與細(xì)胞的分裂，增殖，遷移及壞死等息息相關(guān)，還在細(xì)胞與外部環(huán)境發(fā)生物質(zhì)、能量交換中發(fā)揮重要作用。同時，細(xì)胞膜能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞互相作用，細(xì)胞-細(xì)胞通信和細(xì)胞內(nèi)訊號傳導(dǎo)途徑。因而，對細(xì)胞膜進(jìn)行功能化修飾，有利于推動基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)研究，調(diào)控細(xì)胞間互相作用，操縱細(xì)胞訊號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。目前，已有大量的功能材料被修飾到細(xì)胞膜上，如dna，氨基酸，高分子材料等。在這種材料中，dna因其便于合成，結(jié)構(gòu)可預(yù)測，可編程性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。目前常用的細(xì)胞膜修飾方式有：1.基于基因工程的技巧。該方式通過向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)出新的基因，從而在細(xì)胞膜上持續(xù)抒發(fā)功能蛋白，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的功能化修飾。但是，這些方式不但操作復(fù)雜、耗時，并且可能會導(dǎo)致基因組成分的改變，給細(xì)胞研究帶來不可預(yù)測的影響。2.基于靜電吸附的技巧。細(xì)胞的膜表面帶負(fù)電荷，它可以通過靜電作用吸附帶正電的材料(如聚乙烯吡啶(pei)、多聚賴谷氨酸(pll)等)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的快速修飾。但是，這種帶正電的高分子聚合物一般具有較高的細(xì)胞毒性，但是其在細(xì)胞膜表面的穩(wěn)定性遭到培養(yǎng)基離子硬度的影響(靜電屏蔽作用)，限制了其實(shí)際應(yīng)用范圍。3.基于細(xì)胞代謝的方式。
該方式利用人工合成的糖代謝前體將物理標(biāo)簽(如，疊氮官能團(tuán))整合到細(xì)胞膜表面糖基化蛋白上。借助溫和的點(diǎn)擊物理反應(yīng)，將帶有炔基標(biāo)記的探針修飾到細(xì)胞膜上。這些方式繁雜歷時，通常須要2-3天的代謝標(biāo)記時間細(xì)胞膜蛋白，未能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜的快速修飾。4.基于共價交聯(lián)的技巧。細(xì)胞膜表面抒發(fā)大量的蛋白質(zhì)分子，這種蛋白質(zhì)中富含大量的甲基，乙基等活性羧基。通過酰基與琥珀酰吡啶酯(nhs)、巰基與馬來酰吡啶酯(mal)等反應(yīng)，將探針共價修飾到細(xì)胞膜表面。但該方式具有反應(yīng)效率低，且涉及有機(jī)物理反應(yīng)，可能形成較強(qiáng)的細(xì)胞毒性乃至影響細(xì)胞正常的生理功能。5.基于疏水端插入細(xì)胞膜的技巧。磷脂雙分子層是細(xì)胞膜的主要組成成份之一，其兩端具有親水性，而中間部份具有疏水性。兩親性探針可以借助其疏水端與磷脂雙分子層之間的相像相溶性質(zhì)，自發(fā)錨定到細(xì)胞表面上。此方式因?yàn)榫哂锌焖俑咝А⑵者m性強(qiáng)、生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，遭到了廣泛關(guān)注。但是，目前通過這些方式修飾的探針在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性較差，在復(fù)雜生物體系(如，富含血漿的培養(yǎng)基)中容易從細(xì)胞膜表面開裂。據(jù)悉修飾在膜表面的探針容易與其他成份發(fā)生非特異性互相作用，增加了探針的靶標(biāo)辨識能力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是借助dna納米技術(shù)，建立兩親性dna多面體探針，開發(fā)一種新型的細(xì)胞膜修飾技巧。該方式不但能將探針分子快速、高效、無損地修飾到細(xì)胞膜上，就能明顯提升探針在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性及其分子辨識性能。據(jù)悉，基于dna納米結(jié)構(gòu)的可編程性，該方式可實(shí)現(xiàn)多種功能模塊在細(xì)胞膜的高效自組裝，為細(xì)胞分子生物學(xué)、組織工程及基于細(xì)胞的診治等領(lǐng)域的研究提供了新技術(shù)。
本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的：
一種細(xì)胞膜的功能化修飾方式，通過dna多面體上修飾的疏水分子的疏水作用將其插入到細(xì)胞膜磷脂雙分子層，因而實(shí)現(xiàn)多面體在細(xì)胞膜表面的錨定，在dna多面體沒有修飾疏水分子的頂點(diǎn)延展出dna序列，或則通過延展出的dna序列與其它功能單元結(jié)合完成細(xì)胞膜的功能化修飾。
所述的細(xì)胞膜的功能化修飾方式，dna多面體探針具有四個頂點(diǎn)，其中三個頂點(diǎn)均修飾有疏水分子。
所述的細(xì)胞膜的功能化修飾方式，疏水分子包括：尿酸、二甲基脂類體或生育酚等。
本發(fā)明在dna多面體沒有修飾疏水分子的頂點(diǎn)延展出dna序列，可以用于細(xì)胞膜上分子特異性辨識。
所述的細(xì)胞膜的功能化修飾方式，其他功能單元包括：核苷酸分子，核苷酸適配體、脫氧核酶、小分子、多肽、蛋白或納米顆粒等。小分子包括：抗生素類小分子或發(fā)光官能團(tuán)小分子等，抗生素類小分子包括ce6等。納米顆粒包括：金納米顆粒，磁納米顆粒等。
本發(fā)明還可以通過延展出的dna序列與其它功能單元結(jié)合，實(shí)現(xiàn)各類功能。
例如：
功能單元為核苷酸適配體，其與dna多面體延展出的dna序列互補(bǔ)雜交，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜特異性辨識及細(xì)胞間選擇性團(tuán)聚。
功能單元為抗生素小分子，與dna多面體延展出的dna共價交聯(lián)，可以實(shí)現(xiàn)根治等功能。
功能單元為發(fā)光官能團(tuán)小分子，與dna多面體延展出的dna共價交聯(lián)，可以實(shí)現(xiàn)成像等功能。
所述的細(xì)胞膜的功能化修飾方式，合成多面體所需的四條dna鏈，其中s1,s2,s3均被尿酸()修飾；
s1-cho:
-,如.1所示。
s2-cho:
-,如.2所示。
s3-cho:
-,如.3所示。
s4:
；如.4所示，頓號的核苷酸為延展序列。
所述的細(xì)胞膜的功能化修飾方式，
探針(即一種核苷酸分子，能特異性辨識并結(jié)合抒發(fā)在細(xì)胞表面的ptk7蛋白，從而與高抒發(fā)這些蛋白的細(xì)胞進(jìn)行特異性結(jié)合)與s4中頓號核苷酸所示序列(即延展dna序列)互補(bǔ)；探針序列為：
，如.5所示。
上述序列僅僅為一個具體的優(yōu)選反例，本發(fā)明方式中涉及的dna多面體序列不限于上述具體的序列，只要四條序列之間滿足產(chǎn)生dna多面體結(jié)構(gòu)，并且三個頂點(diǎn)均被疏水分子修飾即可。
本發(fā)明延展出的dna和與之相連的構(gòu)成多面體的序列之間設(shè)置5-8個隨機(jī)核苷酸序列(滿足不影響多面體正常產(chǎn)生的核苷酸，不影響探針辨識功能即可，如5-8個t或a等)更有利于延展出的dna特異性辨識或則結(jié)合其他功能單元。
螢光官能團(tuán)修飾核苷酸的位置只要不影響多面體以及延展序列的功能即可。
所述的細(xì)胞膜的功能化修飾方式，合成的多面體探針與細(xì)胞膜結(jié)合時體系中含量達(dá)到優(yōu)選250nm。
所述的細(xì)胞膜的功能化修飾方式，合成的多面體探針與細(xì)胞膜結(jié)合反應(yīng)時間優(yōu)選10分鐘。
本發(fā)明技術(shù)方案的詳盡闡釋：
1)兩親性dna多面體探針的制備
該dna多面體探針具有四個頂點(diǎn)。其中三個頂點(diǎn)分別修飾一個疏水分子(比如，尿酸分子)，這種疏水分子可通過疏水作用插入到細(xì)胞膜磷脂雙分子層，因而實(shí)現(xiàn)多面體探針在細(xì)胞膜表面的錨定。用第四個頂點(diǎn)延展出一段特定的dna單鏈序列，借助這段dna序列或則通過dna互補(bǔ)雜交引入其他功能單元(比如，核苷酸適配體、脫氧核酶、小分子、多肽、蛋白等)，可用于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜表面的分子辨識或生物催化或醫(yī)治或成像等功能。多面體經(jīng)過三個頂點(diǎn)的疏水性處理才能大大降低其在細(xì)胞膜表面的結(jié)合和穩(wěn)定性，并且多面體具有良好的剛性及明晰的三維結(jié)構(gòu)，有利于探針分子遠(yuǎn)離細(xì)胞膜表面并保持有序的空間定向，進(jìn)而降低探針的靶標(biāo)辨識能力。同時，探針分子模塊選擇的多樣性促使該方式便于制備一系列具有特定功能的膜錨定探針。
兩親性多面體探針的制備流程如下：將合成多面體所需的四條dna鏈
s1-cho:-,
s2-cho:-,
s3-cho:-,
s4：
。
上述s4序列中粗體顯示的7個t即延展出的dna和與之相連的構(gòu)成多面體的序列之間設(shè)置的隨機(jī)核苷酸序列。
將上述序列溶化到pbs緩沖液中(ph＝7.4，鎂離子含量為5mm)，使所有dna鏈條的最終含量均為2μm，之后將該混和濾液在95℃下加熱3分鐘，平緩降至溫度，進(jìn)而制備獲得兩親性dna多面體探針t-cho3，假如s4的7個t的隨機(jī)核苷酸序列中的宋體的核苷酸t(yī)進(jìn)行螢光官能團(tuán)的修飾，則獲得t-cho3-fam(用于本發(fā)明施行例中的t-cho3-fam制備)。
由s1-cho,s2-cho,s3-cho,s4及可制得探針t-cho3-sgc8；
序列為：(制備時體系中的含量2μm)
。
由單個尿酸修飾的單鏈dna分子s-cho1與可制得探針s-cho1-sgc8；
s-cho1序列為：-，如.6所示。
2)表征兩親性多面體探針
2.1)聚丙烯丙酯凝膠電泳表征兩親性多面體探針
用5％聚丙烯丙酯凝膠電泳表征所制備的探針t-cho3。取10μl樣品，加入2μl甘油并充分混和。將混和液加入到5％的聚丙烯丙酯凝膠中，并在110v電流下進(jìn)行45分鐘電泳實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用顏料對聚丙烯丙酯凝膠染色15分鐘，之后用水清洗兩次，并用凝膠成像儀對樣品成像。如圖1所示，s1-cho,s2-cho,s3-cho和s4反應(yīng)后挺好的產(chǎn)生了探針t-cho3(泳道7)。
2.2)原子力顯微鏡成像表征兩親性多面體探針
取15μl制備的t-cho3探針，加入5μl含量為300μm的硫酸鎳，在溫度下混和5分鐘。將混和液滴到云母片，并靜置十分鐘。用分餾水將云母片表面清洗三次，并在氫氣氣氛中進(jìn)行干燥。干燥后的樣品在原子力顯微鏡下進(jìn)行成像。如圖2所示，原子力成像表明合成的t-cho3探針呈均勻，單分散的顆粒狀，其大小為10納米左右。
3)尿酸修飾數(shù)量對多面體探針在細(xì)胞膜上穩(wěn)定性的影響
細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取30萬個cem細(xì)胞，pbs漂洗一次，并均分為3組，之后分別與250nm的t-cho1-fam(dna序列為與t-cho3-fam相同的多面體，但只修飾一個尿酸)，250nm的t-cho2-fam(dna序列為與t-cho3-fam相同的多面體，但只修飾兩個尿酸)和250nm的本發(fā)明方式制備的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分鐘，pbs漂洗一次，分散到富含10％fbs的1640培養(yǎng)基中。三組細(xì)胞均在37℃，5％氧氣環(huán)境下分別培養(yǎng)0小時，0.5小時，1小時，1.5小時，pbs漂洗一次，共聚焦成像觀察探針開裂情況。如圖3所示，探針t-cho1-fam錨定效率低，且開裂速率快，在半小時內(nèi)幾乎全部開裂。t-cho2-fam相較于t-cho1-fam錨定效率提高，開裂速率減緩，但仍遠(yuǎn)高于t-cho3-fam。
4)t-cho3-fam兩親性多面體探針膜錨定條件優(yōu)化：
4.1)膜錨定含量優(yōu)化
細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取60萬個cem細(xì)胞(人急性淋巴細(xì)胞肺癌t淋巴細(xì)胞)，pbs漂洗一次，并均分為6組，之后分別與15.6nm,31.2nm,62.5nm,125nm,250nm,500nm的t-cho3-fam探針在4℃下共孵育10分鐘，pbs漂洗一次，流式細(xì)胞儀測量。如圖4所示細(xì)胞膜蛋白，隨著探針含量的降低，螢光位移顯著降低，當(dāng)探針含量達(dá)到250nm時，探針基本飽和。表明了兩親性多面體探針的高效膜錨定能力。
4.2)膜錨定時間優(yōu)化
細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取60萬個cem細(xì)胞，pbs漂洗一次，并均分為6組，之后分別與250nm的t-cho3-fam在4℃下共孵育1分鐘，2分鐘，5分鐘，10分鐘，20分鐘，30分鐘，pbs漂洗一次，流式細(xì)胞儀測量。如圖5所示，螢光位移值隨孵育時間降低而降低，到10分鐘基本飽和。表明了兩親性多面體探針能快速錨定到細(xì)胞膜。
本發(fā)明的有益療效
本發(fā)明通過制備兩親性dna多面體探針，發(fā)展了一種新型的細(xì)胞膜修飾技巧。與傳統(tǒng)的細(xì)胞膜修飾方式(如基于基因工程的方式，基于共價交聯(lián)的方式及基于細(xì)胞糖代謝的方式)相比，該方式能實(shí)現(xiàn)快速高效的細(xì)胞膜修飾。其修飾時間減短到10分鐘，修飾所需的探針含量也低至250nm。與常規(guī)的兩親性探針(如尿酸修飾的單鏈dna探針)相比，兩親性dna多面體探針具有更高的膜穩(wěn)定性(開裂速率大大增加，內(nèi)吞效率也顯著減少)。同時，dna多面體探針在細(xì)胞膜上的靶標(biāo)辨識能力也相較于常規(guī)的兩親性探針提高3倍。
附圖說明
圖1為聚丙烯丙酯凝膠電泳表征探針的產(chǎn)生。條帶1：s1，條帶2：s1+s2,條帶3:s1+s2+s3,條帶4:s1+s2+s3+s4,條帶5：s-cho1+s2+s3+s4,條帶6：s-cho1+s-cho2+s3+s4,條帶7：s-cho1+s-cho2+s-cho3+s4(t-cho3)。
圖2為原子力顯微鏡成像表征本發(fā)明兩親性dna多面體探針的產(chǎn)生；
圖中比列尺代表100nm。
圖3為尿酸修飾數(shù)量對多面體探針在細(xì)胞膜上穩(wěn)定性的影響；
(a)為共聚焦表征三種探針膜開裂速率，圖中比列尺代表10μm；
(b)為螢光統(tǒng)計(jì)表征三種探針開裂速率。
圖4為流式優(yōu)化探針膜錨定含量。
圖5為流式優(yōu)化探針膜錨定時間。
圖6(a)為共聚焦表征兩種探針膜開裂速率，圖中比列尺代表10μm；
(b)為螢光統(tǒng)計(jì)表征兩種探針開裂速率。
圖7(a)為共聚焦表征兩種探針的內(nèi)吞效率，箭頭指示了內(nèi)吞步入細(xì)胞的探針，圖中比列尺代表10μm；
(b)為螢光統(tǒng)計(jì)表征兩種探針的內(nèi)吞效率。
圖8(a)為細(xì)胞集聚效率的統(tǒng)計(jì)，
(b)為romos細(xì)胞膜表面中單條sgc8探針導(dǎo)致的細(xì)胞集聚起始速率。
具體施行方法
以下結(jié)合施行例借以進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
施行例1：本發(fā)明兩親性多面體探針在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性
兩親性多面體探針增加的開裂速率
細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取20萬個cem細(xì)胞，pbs漂洗一次，并均分為2組，之后分別與250nm的s-cho1-fam(序列為：-//--,代表該處的核苷酸t(yī)被螢光官能團(tuán)修飾)和250nm的本發(fā)明方式制備的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分鐘，pbs漂洗一次，分散到富含10％fbs的1640培養(yǎng)基中。兩組細(xì)胞均在37℃，5％氧氣環(huán)境下分別培養(yǎng)0小時，0.5小時，1小時，1.5小時，pbs漂洗一次，共聚焦成像觀察探針開裂情況。如圖6所示，探針s-cho1-fam在半小時內(nèi)幾乎全部開裂，而探針t-cho3-fam雖然在1.5小時，也只有不到20％的開裂。闡明了本發(fā)明使用的兩親性多面體探針相對于傳統(tǒng)兩親性探針大大增強(qiáng)了在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性。
施行例2：本發(fā)明兩親性多面體探針增加的內(nèi)吞效率
細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取20萬個cem細(xì)胞，pbs漂洗一次，并均分為2組，之后分別與250nm的s-cho1-fam和250nm的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分鐘，pbs漂洗一次，分散到富含5mm硫酸鎂的pbs中。兩組細(xì)胞均在37℃下培養(yǎng)15分鐘，共聚焦成像觀察探針內(nèi)吞情況。如圖7所示，探針s-cho1-fam在培養(yǎng)15分鐘后，發(fā)生了顯著的內(nèi)吞，而探針t-cho3-fam無顯著內(nèi)吞。闡明了兩親性多面體探針相對于傳統(tǒng)兩親性探針的大大增強(qiáng)了在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性。
施行例3：本發(fā)明兩親性多面體探針在細(xì)胞膜上提高靶標(biāo)辨識能力
細(xì)胞計(jì)數(shù)后，取20萬個ramos細(xì)胞，用白色活細(xì)胞示蹤劑()在37℃下染色15分鐘,pbs漂洗一次，并均分為2組。之后分別與250nm的t-cho3-sgc8探針和250nm的s-cho1-sgc8探針在4℃下共孵育10分鐘，pbs漂洗一次，分散到富含2％牛血清白蛋白(bsa)的dpbs中。再取200萬個cem細(xì)胞，均分為兩組，分別加到上述兩組ramos細(xì)胞中，并在溫度下晃動()10分鐘，20分鐘，30分鐘，60分鐘，90分鐘，120分鐘，240分鐘，360分鐘，540分鐘。用共聚焦顯微鏡對不同時間點(diǎn)的樣品進(jìn)行成像，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞圖團(tuán)聚效率。如圖8所示，t-cho3-sgc8探針修飾的ramos細(xì)胞才能快速辨識cem細(xì)胞，并導(dǎo)致高效的細(xì)胞團(tuán)聚(60分鐘后，集聚效率超過了85％)。同時，這些細(xì)胞集聚狀態(tài)有較高的穩(wěn)定性，雖然720分鐘后，細(xì)胞集聚效率仍高達(dá)60％。但是，s-cho1-sgc8探針修飾的ramos細(xì)胞對cem細(xì)胞的辨識能力較差，在30分鐘時，細(xì)胞的集聚效率達(dá)到最高峰值(僅約為25％)，此后快速增長，說明了在s-cho1-sgc8探針體系中，細(xì)胞集聚狀態(tài)的穩(wěn)定性較差。通過估算romos細(xì)胞膜表面中單條sgc8探針導(dǎo)致的細(xì)胞集聚起始速率，可以得出t-cho3-sgc8的分子辨識能力要顯著低于s-cho1-sgc8探針3倍。
序列表
青海學(xué)院
一種細(xì)胞膜的功能化修飾技巧
.0
57
dna
未知()
57
dna
未知()
57
dna
未知()
75
dna
未知()
60
60
dna
未知()
60
28
dna
未知()
技術(shù)特點(diǎn)：
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種細(xì)胞膜的功能化修飾技巧。通過DNA多面體上修飾的疏水分子的疏水作用將其插入到細(xì)胞膜磷脂雙分子層，因而實(shí)現(xiàn)多面體在細(xì)胞膜表面的錨定，在DNA多面體沒有修飾疏水分子的頂點(diǎn)延展出DNA序列，或則通過延展出的DNA序列與其它功能單元結(jié)合完成細(xì)胞膜的功能化修飾。該方式不但能將探針分子快速、高效、無損地修飾到細(xì)胞膜上，就能明顯提升探針在細(xì)胞膜上的穩(wěn)定性及其分子辨識性能。據(jù)悉，基于DNA納米結(jié)構(gòu)的可編程性，可實(shí)現(xiàn)多種功能模塊在細(xì)胞膜的高效自組裝，為細(xì)胞分子生物學(xué)、組織工程及基于細(xì)胞的診治等領(lǐng)域的研究提供了新技術(shù)。
技術(shù)研制人員：譚蔚泓;邱麗萍;李進(jìn)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東學(xué)院
技術(shù)研制日：2019.06.11
技術(shù)公布日：2019.08.27