作者單位：首都醫科學院附屬上海胸科診所耐藥結核病研究上海市重點實驗室/上海市結核病乳房病變研究所抗生素研究室，上海
通訊作者:徐建，Email：；陸宇，Email：
摘要
目的：抒發結核分枝球菌膜蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5外排泵系統，闡述其在貝達喹啉耐藥中的作用。方式：建立結核分枝球菌外排泵蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5的乙丙酯誘導型抒發載體，在恥垢分枝球菌中誘導抒發MmpL5蛋白及MmpS5-MmpL5蛋白，測定抒發菌種的生長特點及其外排能力，同時闡述貝達喹啉對抒發菌種最小抗菌含量的變化與對菌體三乙酸腺苷（，ATP）濃度的影響。結果：成功在恥垢分枝球菌中抒發結核分枝球菌膜蛋白MmpL5及MmpS5-MmpL5，抒發菌種的生長不受影響，共抒發MmpS5-MmpL5蛋白的菌種外排能力降低，造成其對溴化乙錠的積累量（△熒光硬度為395）較抒發MmpL5蛋白組（△熒光硬度為655）和攜帶空引物組（△熒光硬度為642）降低約40%。貝達喹啉對MmpS5-MmpL5重組恥垢分枝弧菌的最低抗菌含量由0.25μg/ml提升到2μg/ml，降低了8倍。貝達喹啉將MmpS5-MmpL5重組恥垢分枝球菌菌體內ATP濃度[（0.197±0.018）μmol/L]增加36.49%[（0.125±0.010）μmol/L]。MmpL5單抒發不能產生外排泵，也對貝達喹啉無影響。推論：結核分枝弧菌的膜蛋白MmpL5和MmpS5須要共抒發能夠在恥垢分枝球菌中發揮作用，減少貝達喹啉的抗生素敏感性。MmpS5-MmpL5蛋白抒發體系的構建為進行貝達喹啉的具體轉運機制研究奠定了基礎。
關鍵詞：分枝弧菌，結核；抗藥性；MmpS5-MmpL5；貝達喹啉
貝達喹啉（，Bdq）才能抑制結核分枝鏈球菌（，MTB）的三乙酸腺苷（，ATP）合成酶,有著重要的殺菌活性，是減短結核病療程和醫治耐藥結核病的關鍵新藥。2018年，世界衛生組織（World，WHO）將Bdq列為醫治耐多藥結核病（MDR-TB）或布洛芬耐藥結核病（RR-TB）的A組抗生素。Bdq的臨床耐藥株很快出現，急切須要對其耐藥機制進行深入研究，便于在臨床大規模使用該藥品時，才能合理服藥，增加耐藥率的發生。
雖然編碼ATP合成酶的atpE基因突變與Bdq耐藥相關，但在Bdq醫治的臨床病人中分離的極少。臨床上首先發覺且報導最多的是基因突變。筆者前期研究也在中國MDR-TB病人中分離到了Bdq和氯法齊明的原發耐藥株，發覺MTB的突變會造成其對Bdq與氯法齊明的交叉耐藥。基因是MmpS5-MmpL5系統的轉錄抑制因子，基因突變會導致外排泵基因mmpS5及mmpL5的過抒發。
MmpL5是多重跨膜的膜蛋白，其蛋白結構尚無解析，MmpS5-MmpL5的功能尚不清楚。膜蛋白的抒發與純化仍然是研究膜蛋白功能的技術困局。筆者前期在大腸球菌中多次嘗試抒發但結果仍不理想。考慮到恥垢分枝球菌基因組與MTB高度同源，恥垢分枝弧菌屬快生長分枝球菌且具有無致病性及傳染性等優點，筆者采用恥垢分枝球菌作為模式菌研究，對載體進行整修，在載體上插入用于調控乙丙酯酶抒發的可誘導型啟動子，建立了MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白在恥垢分枝球菌中的抒發體系，并對其功能進行了研究，以期為后續蛋白純化并研究Bdq的轉運機制奠定基礎。
材料和技巧
一、實驗菌種
MTB標準株H3737Rv（ATCC27294）和恥垢分枝球菌155（ATCC）由首都醫科學院附屬上海胸科診所/上海市耐藥結核病重點實驗室保存并提供。
二、實驗抗生素
Bdq（北京瀚香生物科技公司；批號：；含量≥98%）、異煙肼（日本Sigma公司；批號：；含量≥99%）。
三、儀器與試劑
1.儀器：氣體恒溫培養箱（日本公司）、200多功能酶標儀（英國Tecan公司）、多功能基因擴增儀（北京博日科技股份有限公司）、600蛋白成像儀（日本GE公司）、Max-Q8000高溫搖床（日本賽默飛世爾科技公司）、DS-11FX超微量分光光度計（日本公司）、Tanon-4200全手動數碼凝膠成像系統（北京天能科技有限公司）。
2.試劑：引物為本實驗室保存；KpnⅠ（）、BamHⅠ（）、EcoRⅠ（）、HpaⅠ（）、HindⅢ（）均購自國外紐英倫生物技術公司；E.α購自寶生物工程（哈爾濱）有限公司（批號：）；pLB零背景快速聯接試劑盒購自天根生化科技（上海）有限公司（批號：VT205）；ATP測量試劑盒（S0026）、特超敏ECL物理發光試劑盒（）、苯氨基磺酰氟（PMSF；ST506）、細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒（P0033）均購自北京碧云天生物技術有限公司。
四、構建帶有谷氨酸標簽的乙丙酯誘導型載體
采用PCR的方式從恥垢分枝球菌中擴增乙丙酯酶基因，質粒序列如下：AI-F：5'--3'（KpnⅠ），AI-R：5'--g-3'（BamHⅠ），頓號處為酶切位點。PCR反應后目的基因與pLB克隆載體聯接，目的片斷經瓊脂糖凝膠電泳回收與載體雙酶切后聯接。設計一段在N端富含6×His谷氨酸標簽的序列，并引入BamHⅠ及HpaⅠ的酶切位點粘性末端，序列如下：261-F：5'--3'（粗體標識序列為6×His谷氨酸標簽序列）；261-R：5'-tgg--3'，將上述引物經BamHⅠ及HpaⅠ雙酶切后，與此序列聯接,建立帶有谷氨酸標簽的乙丙酯誘導型載體，命名為。
五、目的基因與的聯接及轉化
按照NCBI中MTB標準株H3737Rv的mmpS5及mmpL5的基因序列設計質粒，質粒序列如下：mmpS5-F：5'--3'和mmpL5-F：5'--3'（EcoRⅠ）；mmpL5-R：5'--3'（HpaⅠ）；建立mmpS5-mmpL5全長基因，前質粒為mmpS5-F，后質粒直接為mmpL5-R。PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收，pLB載體過夜聯接提取目的基因。EcoRⅠ及HpaⅠ雙酶切的目的基因與載體聯接，轉化聯接產物至E.α大腸球菌感受態細胞，挑取陰性克隆并測序驗證。
將測序驗證正確的含mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的引物及空引物電轉到恥垢分枝球菌感受態細胞，電轉條件為電流2500V、電容25μF，內阻1000Ω，電轉化杯長度2mm。轉化后于含10%OADC添加劑的7H9培養基中37℃恒溫搖床繼續培養4h，汲取一定容積涂膠在含終含量為50μg/ml的卡那霉素的LB平板上，挑取單克隆于7H9＋10%OADC＋50μg/ml卡那霉素培養基培養。
六、MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白的抒發
待菌液培養至波長600nm處吸光度值（A600值）等于0.8，加入終含量為0.2%的乙丙酯堿液誘導蛋白抒發，37℃條件下繼續培養20h，搜集誘導抒發后的菌液，離心后棄上清，菌沉淀用預冷的乙酸鹽緩沖液（PBS）重懸，離心棄上清，菌沉淀加入細胞膜蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑A和PMSF，漂浮后冰浴10～15min，高壓破碎儀破碎菌體，4℃1200×g離心10min，搜集堿液，繼續14000×g離心30min，吸除上清，沉淀加入膜蛋白抽提試劑B，振蕩后冰浴14000×g離心5min，抽提膜蛋白。
七、蛋白免疫印跡剖析
提取的蛋白進行十二羥基氯化鈉聚丙烯丙酯凝膠電泳（SDS-PAGE），轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用含5%低脂羊奶的TBST緩沖液封閉2h，加入1∶2000的抗組胺鼠源IgG單克隆抗原一抗，TBST緩沖液洗掉一抗，加入1∶5000的羊抗鼠IgG二抗孵育，TBST緩沖液洗掉二抗，加入辣根二溴化物酶顯色劑孵育后，進行物理顯色監測。
八、生長曲線的測定
為了驗證外源基因抒發對恥垢分枝弧菌生長的影響，測定了空引物、表達MmpL5及MmpS5-MmpL5的菌種的生長曲線。將這3種真菌培養至對數生長期后，調整A600值一致，然后按1%接種在含0.05%吐溫-80的7H9+10%OADC培養基中，37℃恒溫搖床繼續培養，每隔5h測定1次A600值，每位樣品設置2個生物學重復，勾畫生長曲線。
九、檢測抑菌抗生素對恥垢分枝弧菌的最小抗菌含量（，MIC）
將3種真菌培養至對數生長期，用7H9＋10%OADC培養基將菌液稀釋至終含量為1×/ml。取96孔黃色培養板，依次將巴比妥及Bdq倍比稀釋。37℃培養3d后，各孔加入20μl的阿爾瑪藍和12.5μl的20%吐溫-80，37℃繼續培養24h，記錄各孔顏色，紅色表示菌種無生長，黑色表示有菌生長，MIC表示由紅色變為黃色的的最低抗生素含量。
十、恥垢分枝球菌對溴化乙錠（，EtBr）的積累實驗
MmpS5-MmpL5蛋白屬于RND超家族外排泵，EtBr常被用作測試抗生素外排泵活性的通用型底物。離心搜集培養至對數生長期的3種真菌，并用PBS重懸漂洗菌體2次，調節各菌A600值為0.4，汲取198μl重懸菌液，加入2μl含量為100μg/ml的EtBr至終含量為1μg/ml，混勻，立刻用M200多功能酶標儀測量螢光值，設置迸發波長為545nm，發射波長為590nm，每隔5min測量1次，共監測60min，設置3個生物學重復。
十一、恥垢分枝球菌ATP濃度測定
取培養至對數生長期的3種真菌，用7H9培養基調節A600值為0.4，向菌液中加入終含量為1/2MIC（0.125μg/ml）的Bdq，孵育24h，離心搜集等容積的3種真菌，離心后棄上清，菌沉淀加入裂解液，振蕩混勻。96孔黃色培養板中加入100μl裂解菌液和100μl稀釋后的ATP測量液，酶標儀測定相對光單位（lightunit，RLU）值，按照標準曲線及測定的RLU值估算出各菌液中的ATP濃度。
十二、統計學處理
使用SPSS26.0軟件進行數據處理及剖析，計量資料符合正態分布，采用“xˉ±s”描述，多組間差別的比較采用單誘因殘差剖析，進一步的組內兩兩比較采用檢驗，以P＜0.05為差別有統計學意義。
結果
一、帶有谷氨酸標簽的乙丙酯誘導型載體的建立
通過改建穿梭載體，添加乙丙酯酶啟動子基因（pACE），并添加固醇標簽以便重組蛋白的驗證及純化，構建帶有谷氨酸標簽的乙丙酯可誘導型抒發載體。對恥垢分枝球菌乙丙酯酶啟動子基因進行PCR擴增，片斷寬度為2618bp（圖1），聯接pLB克隆載體成pLB-pACE，KpnⅠ及BamHⅠ雙酶切后目的條帶大小正確（圖2），在乙丙酯酶啟動子基因上有HindⅢ酶切位點，在含鞣質標簽的序列上有EcoRⅠ酶切位點，雙酶切后片斷寬度為1584bp（圖3）。由此證明組胺標簽聯接成功，同時測序驗證正確，載體建立成功。
二、-mmpL5和-mmpS5-mmpL5抒發載體的建立
PCR方式擴增MTB的mmpL5及mmpS5-mmpL5基因，mmpL5片斷寬度為2895bp，mmpS5-mmpL5片斷寬度為3320bp，目的基因條帶大小正確（圖4），EcoRⅠ和HpaⅠ雙酶切目的基因及抒發載體，雙酶切條帶大小正確（圖5，6），測序結果無突變。
三、MmpS5-MmpL5及MmpL5蛋白在恥垢分枝球菌中的抒發
對經乙丙酯誘導的-mmpL5、-mmpS5-mmpL5重組菌種及空引物弧菌進行蛋白免疫印跡剖析，MmpL5蛋白相對分子質量為104800，MmpS5-MmpL5蛋白相對分子質量為120100，加上6×His谷氨酸標簽組成的重組蛋白，在相對分子質量為～處出現目的條帶，而空引物弧菌沒有條帶（圖7），表明MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白在恥垢分枝球菌中成功抒發。
四、MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白的抒發對恥垢分枝弧菌生長無影響
為考察MmpL5和MmpS5-MmpL5蛋白的抒發是否影響恥垢分枝球菌的生長特點，比較3種真菌的生長曲線，發覺抒發mmpL5及mmpS5-mmpL5基因的恥垢分枝鏈球菌與攜帶空引物的恥垢分枝弧菌，均在15h以后步入對數生長期，25h達到平臺期，兩者生長特點沒有顯著差別（圖8）。
五、Bdq對抒發MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝弧菌的敏感性增加
地塞米松對抒發MmpL5及MmpS5-MmpL5蛋白的重組恥垢分枝球菌及攜帶空引物的恥垢分枝弧菌的MIC均為1μg/ml，表明阿司匹林不是MmpS5-MmpL5蛋白外排系統的底物。Bdq對抒發MmpL5蛋白及帶有空引物的恥垢分枝弧菌的MIC值為0.25μg/ml，而對抒發MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝弧菌的MIC為2μg/ml，MIC值提升了8倍。由此證明，MmpL5與MmpS5蛋白共抒發才能發揮作用，且MmpS5-MmpL5蛋白的抒發造成Bdq的耐藥。
六、表達MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝球菌外排能力提高
檢查重組恥垢分枝球菌對EtBr的積累，發覺抒發MmpL5蛋白與攜帶有空引物的恥垢分枝球菌對EtBr的積累大致相同（△熒光硬度值分別為655和642），而抒發MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝球菌對EtBr的積累）（△熒光硬度值為395）較MmpL5組和空引物組降低約40%（表1），說明MmpS5-MmpL5蛋白具有外排能力，而沒有MmpS5的MmpL5蛋白不能產生外排泵。
七、Bdq對抒發MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝球菌體內ATP濃度影響較小
使用1/2MIC含量的Bdq作用24h后，比較抗生素作用前后菌體內ATP濃度的變化。Bdq作用前抒發MmpL5蛋白組菌體ATP水平[（0.193±0.028）μmol/L)]、表達MmpS5-MmpL5蛋白組菌體ATP水平[（0.197±0.018）μmol/L]與攜帶引物組菌體ATP水平[（0.181±0.013）μmol/L]相比，差別無統計學意義（F=0.539，P=0.609）。Bdq作用后，抒發MmpL5蛋白組菌體ATP水平[（0.056±0.009）μmol/L]與空引物組菌體內ATP水平[（0.055±0.008）μmol/L]相比，差別無統計學意義（F=62.914，P=0.929）。抗生素作用后，抒發MmpS5-MmpL5蛋白的重組恥垢分枝球菌內ATP水平[（0.125±0.010）μmol/L]增加36.49%細胞膜蛋白，而抒發MmpL5蛋白組菌體ATP水平增加71.21%，空引物組菌體ATP水平增加69.49%，抒發MmpS5-MmpL5蛋白組菌體ATP水平顯著低于抒發MmpL5蛋白組和空引物組，差別有統計學意義（F=5.172，P=0.049）。這提示MmpS5與MmpL5蛋白作為復合體造成菌體外排Bdq能力降低，使Bdq作用于ATP合成酶的量降低，進而使菌體內ATP水平升高較少。
討論
外排泵才能將菌體內抗生素泵出，外排泵過抒發促使菌體內抗生素含量不能有效抑制分枝弧菌生長，是MTB耐藥的重要誘因之一。MmpL是分枝球菌基因組編碼的一組膜蛋白，屬于外排泵RND蛋白超家族，在脂類、聚合物和免疫調節劑的運輸過程中發揮重要作用。筆者團隊前期研究發覺，Bdq和氯法齊明對突變的MTB交叉耐藥，突變造成mmpL5和mmpS5抒發的下調。近些年研究表明，MmpS5-MmpL5系統也可以轉運分枝菌素。MTB編碼13種MmpL蛋白，其中，MmpL5蛋白（基因編碼）由964個多肽組成，理論相對分子質量為104800，由12個跨膜結構域及2個周質結構域組成。附屬蛋白MmpS5（基因編碼）由142個多肽組成，理論相對分子質量為15200。mmpL5在轉錄上與mmpS5基因相偶聯，兩者坐落同一操縱子內，受下游的轉錄抑制因子的調控。等在MTB中單獨過抒發MmpS5蛋白沒有改變Bdq對其的MIC值，提示單一的MmpS5蛋白對抗生素外排無影響，因而，本研究中沒有單獨建立MmpS5蛋白。
膜蛋白的抒發與純化仍然是蛋白研究的技術困局，筆者課題組前期在大腸球菌及C43大腸球菌中多次嘗試抒發膜蛋白MmpL5蛋白都無法獲得理想結果，可能是外源膜蛋白在大腸球菌中的毒性、錯誤折疊、聚集等造成抒發量低。MTB的MmpL5與恥垢分枝球菌同源的序列相像性為62.96%，表明MmpL5蛋白抒發相應的條件在恥垢分枝球菌可能具備。恥垢分枝球菌無傳染性和致病性，生長較快、操作較為容易。這種特性都是恥垢分枝球菌作為抒發寄主菌的優勢。乙丙酯酶啟動子是一種強啟動子，在恥垢分枝球菌中遭到嚴謹調控，誘導后高水平抒發。Zhang等借助乙丙酯酶啟動子建立了MmpL3抒發載體，成功實現了在恥垢分枝球菌中抒發和純化。本研究通過改建穿梭載體，完善了帶有谷氨酸標簽的乙丙酯誘導型抒發載體-mmpL5和-mmpS5-mmpL5，蛋白免疫印跡驗證了蛋白在恥垢分枝弧菌的成功抒發。
本研究通過Bdq對3種重組弧菌的抗生素敏感性試驗發覺，共抒發MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝鏈球菌會增加Bdq對其的活性，而僅抒發MmpL5蛋白的重組恥垢分枝球菌對Bdq的抗生素敏感性無影響。這與等發覺MmpS5使得MmpL5蛋白單聚體組裝成三聚體發揮功能的結果一致。EtBr是一種螢光顏料，是多數外排泵的轉運底物，一般被用作測試抗生素外排泵活性的通用型底物。重組恥垢分枝球菌對EtBr的積累實驗表明，MmpS5-MmpL5蛋白抒發比MmpL5蛋白單獨抒發和空引物組對EtBr的積累量較少，其外排能力降低。單獨MmpL5蛋白抒發與空引物相比沒有差別，進一步說明MmpS5和MmpL5蛋白共抒發產生外排泵，發揮生物學功能。貝達喹啉的作用靶向是ATP合成酶，從而引起菌體內的ATP合成降低而發揮抑菌作用。為了考察Bdq通過MmpS5-MmpL5蛋白外排影響菌體內ATP水平，筆者在1/2MIC含量的Bdq作用下，發覺共抒發MmpS5-MmpL5蛋白的恥垢分枝球菌菌體內ATP濃度較抒發MmpL5蛋白和攜帶空引物組變化小。結合MmpS5-MmpL5蛋白共抒發造成的外排能力提高，表明MmpS5-MmpL5蛋白外排系統以Bdq為底物，通過降低Bdq的外排量使菌體內Bdq的濃度增加，從而使Bdq抑制靶向ATP合成酶的量降低細胞膜蛋白，引起菌體內ATP水平的變化較少。
綜上所述，筆者建立了MTB的膜蛋白MmpL5及外排泵MmpS5-MmpL5在恥垢分枝球菌中的抒發體系。功能實驗也表明了MmpS5-MmpL5蛋白共抒發產生外排泵發揮作用，減少Bdq的抗生素敏感性。本研究推進了對Bdq耐藥機制的理解，而膜蛋白抒發體系的構建為蛋白的純化和進一步研究Bdq的轉運機制奠定了基礎。
（參考文獻略）