細(xì)胞膜既是保護(hù)細(xì)胞的重要屏障，也是細(xì)胞與外界物質(zhì)和信息交換的界面。空間總長(zhǎng)度約為10納米的細(xì)胞膜（含突出于細(xì)胞膜外側(cè)的膜蛋白結(jié)構(gòu)）可被視為準(zhǔn)二維匯聚相體系。磷脂單層膜及鑲嵌于膜上的諸多蛋白質(zhì)，整體上具有“多重界面復(fù)雜流體"的行為和特點(diǎn)。膜本身的二維流動(dòng)性和三維起伏漲落為膜蛋白動(dòng)力學(xué)的精密檢測(cè)導(dǎo)致嚴(yán)重干擾。膜蛋白動(dòng)力學(xué)的實(shí)時(shí)精密檢測(cè)，仍然是膜生物化學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的問題。為解決這一困局，中國(guó)科大學(xué)數(shù)學(xué)研究所SM4組近些年來(lái)發(fā)展了針對(duì)體外生物膜模型系統(tǒng)的單分子表面誘導(dǎo)螢光衰逝技術(shù)（SIFA）【Nat..7:12906,2016】和脂類體包裹螢光悠逝檢測(cè)技術(shù)（）【Angew.Chem.58:5577,2019】，分別實(shí)現(xiàn)了固體表面支撐的二維脂單層膜界面和三維脂類體單層膜界面上的生物大分子跨膜動(dòng)力學(xué)的高精度觀測(cè)，可直觀詮釋跨膜肽以及膜蛋白等在垂直生物膜方向上的動(dòng)態(tài)過程，并由此獲取了相關(guān)生物大分子在跨膜過程中的關(guān)鍵動(dòng)力學(xué)信息，為在分子層面闡明生物膜界面跨膜輸運(yùn)的動(dòng)力學(xué)機(jī)理打下了重要基礎(chǔ)。上述“干凈”的數(shù)學(xué)模型系統(tǒng)，還不能有效應(yīng)用于復(fù)雜的活細(xì)胞膜研究。活細(xì)胞中的生物界面體系組分更為復(fù)雜，蘊(yùn)藏著愈發(fā)豐富且重要的生命過程。
近來(lái)細(xì)胞膜模型制作，中國(guó)科大學(xué)數(shù)學(xué)研究所/上海匯聚態(tài)化學(xué)國(guó)家研究中心軟物質(zhì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的博士生侯文清、博士后馬東飛和賀小龍等在陸穎副研究員和李明研究員的指導(dǎo)下，先前序發(fā)展的高精度數(shù)學(xué)檢測(cè)方式為基礎(chǔ)，發(fā)展了專門針對(duì)活細(xì)胞膜界面膜蛋白動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的高精度方式，因而對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了深入研究。該方式命名為細(xì)胞外環(huán)境填充螢光受體的螢光共振能量轉(zhuǎn)移（FRETwithin,簡(jiǎn)稱）。該技巧應(yīng)用單點(diǎn)對(duì)多點(diǎn)的螢光分子間共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理，通過檢測(cè)螢光標(biāo)記分子的螢光硬度或螢光壽命，可精確觀察標(biāo)記位點(diǎn)的插膜深度隨時(shí)間的變化。該方式以好于1納米（約等于細(xì)胞膜總長(zhǎng)度的非常之一）的精度偵測(cè)細(xì)胞膜上單個(gè)膜蛋白的動(dòng)力學(xué)。這是迄今為止測(cè)量活細(xì)胞膜單個(gè)蛋白沿膜法線方向運(yùn)動(dòng)的最高精度。應(yīng)用這個(gè)方式，可以解決往年蛋白質(zhì)與膜互相作用研究中的眾多挑戰(zhàn)性問題，包括膜蛋白的跨膜動(dòng)力學(xué)、膜蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變以及細(xì)胞訊號(hào)感知與響應(yīng)等。
細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜。細(xì)胞膜上生物大分子的動(dòng)力學(xué)，有些是由它自身的特點(diǎn)和功能決定的，有些是由跟它互相作用的其他蛋白質(zhì)決定的。三項(xiàng)技術(shù)聯(lián)用，可以解決這個(gè)二選一的困局。諸如，倘若是后者細(xì)胞膜模型制作，這么在活細(xì)胞膜上表現(xiàn)下來(lái)的動(dòng)力學(xué)，亦可以在“干凈”的模型系統(tǒng)中觀察到。假如是前者，則只能在真實(shí)膜系統(tǒng)中觀察到。這時(shí)侯，研究人員可以通過在模型系統(tǒng)中融合潛在互相作用對(duì)象的方法，找出決定該蛋白動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的其他生物大分子。以上系列檢測(cè)方式的最大優(yōu)勢(shì)是無(wú)需改變生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室普遍采用的商業(yè)螢光顯微鏡的結(jié)構(gòu)和運(yùn)行模式，以便推廣。對(duì)膜上的生物大分子進(jìn)行螢光標(biāo)記后，針對(duì)不同的研究對(duì)象，可采取不同的觀察策略。既可以用全內(nèi)反射螢光顯微鏡又可以用共聚焦螢光壽命顯微鏡對(duì)目標(biāo)進(jìn)行有效觀察：基于全內(nèi)反射螢光顯微鏡可以觀察貼壁細(xì)胞；基于共聚焦螢光壽命顯微鏡可以觀察不能貼壁的漂浮細(xì)胞。
圖1.原理示意圖。螢光供體對(duì)細(xì)胞外填充螢光受體的能量轉(zhuǎn)移。
圖2.基于全內(nèi)反射顯微鏡的細(xì)胞膜內(nèi)外磷脂分子剖析。
圖3.基于共聚焦螢光壽命顯微鏡的細(xì)胞膜內(nèi)外磷脂分子剖析。
相關(guān)研究成果以“-ofofinusingin”為題發(fā)表在Nano上。博士生侯文清，博士后馬東飛和賀小龍為共同第一作者。陸穎副研究員和李明研究員為共同通信作者。該工作得到了科技部重點(diǎn)研制計(jì)劃（）、國(guó)家自然科學(xué)基金委（，和）、中國(guó)科大學(xué)前沿項(xiàng)目（QYZDJ-SSW-和ZDBS-LY-）和中科院青促會(huì)等的支持。