DXY網(wǎng)友問：本人核漿分離做了最少兩個(gè)月了吧，雖然沒有哪些進(jìn)展細(xì)胞膜蛋白，我想請(qǐng)問高手賜教一下。我很想曉得我的配方有哪些問題，或則是我的操作有哪些須要注意的地方。非常謝謝！還有，我檢查的方式是用Ikb-α（標(biāo)細(xì)胞質(zhì)）和Oct-1（標(biāo)細(xì)胞核），雖然抗原也不是挺好用。我做的是BT474細(xì)胞，cell。
我的方式如下：
1、用A漂洗
2、500G離心5分鐘
3、用+B（2：1）裂解細(xì)胞，輕輕混勻，孵育5-10分鐘
4、離心10分鐘（上清：細(xì)胞質(zhì)。沉淀：細(xì)胞核和細(xì)胞膜）
5、PBD漂洗細(xì)胞兩次，12000G離心10分鐘
6、C裂解細(xì)胞膜（裝入液氮中快速冷藏，在冰上熔化10分鐘）
7、離心10分鐘（上清：細(xì)胞核。沉淀：細(xì)胞膜）
8、用PBS漂洗
9、用PRPA在冰上放置30分鐘
10、12000G離心10分鐘（上清：細(xì)胞膜）
：10mmol/LHepes7.5；10mmol/Lkcl；1.5mmol/LMgcl2；0.5mmol/LDTT；1mmol/LNaF；1mmol/L；1/50ml
：+0.15%ofP-40；
：20mmol/LHepes7.5；420mmol/LNacl；1.5mmol/LMgcl2；0.5mmol/LDTT；1mmol/LNaF；1mmol/L；1/50ml
DXY網(wǎng)友回復(fù)：你是不是分離細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，之后做發(fā)覺細(xì)胞核中也有Ikb-α，或則細(xì)胞漿中也能測(cè)量到Oct-1啊？假如是或則細(xì)胞膜蛋白，我感覺挺正常的，由于轉(zhuǎn)錄因子部份也存在于細(xì)胞漿，至于Ikb-α是不是細(xì)胞質(zhì)特異性的我就不清楚了。并且，我認(rèn)為你用的是試劑盒應(yīng)當(dāng)沒有問題的，但是也很難徹底分開，在步驟4汲取上清時(shí)當(dāng)心點(diǎn)，不要觸碰沉淀，可以剩少許上清（這部份上清不搜集），之后用白尖再把這種上清吸干凈丟棄，這樣可以盡量降低各個(gè)組分的污染。我用過試劑盒分過細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白，覺得挺好，起碼不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。假如，你想精確的徹底的分離，或則想得到Oct-1的話，建議你采用蔗糖梯度離心方式再度富集你搜集的各個(gè)組分上清，這可以分離得到比較純的你想要檢查的這些蛋白組分。
樓主問：謝謝賜教，我有如下幾個(gè)問題，謝謝回答
1、在實(shí)驗(yàn)過程中，我搜集上清的時(shí)侯的確是搜集一部份，然而剩下的沒有棄下，上次改進(jìn)。
2、對(duì)于我的抗原。Ikb-α是多克隆抗原，非特異性很強(qiáng)，覺得非常難做；OCT-1其實(shí)是單抗，但我基本上沒有檢查它應(yīng)當(dāng)?shù)拇笮。?0K左右），只是檢查到其它的分子量，不清楚為何，大約40多K吧！
3、我想請(qǐng)問您用試劑盒的療效不影響實(shí)驗(yàn)是哪些意思？那那個(gè)牌子的試劑盒好用，還有，您檢查的方式跟我的抗原一樣嗎？
4、我的配方上面仍然是加好了DTT的，不現(xiàn)加現(xiàn)用有哪些后果嗎？
DXY網(wǎng)友回復(fù)：首先我做的抗原跟你不一樣，但我可以回答你的問題：
2.我用的大部份抗原多是多克隆抗原，也會(huì)有其他非特異性帶，而且不論如何目的帶總是最顯著的，基本上不會(huì)影響結(jié)果，但是我也發(fā)覺不同的來(lái)源的細(xì)胞用同一種抗原，有的就不會(huì)用其他非特異性帶，有的不管怎樣就會(huì)有非特點(diǎn)帶，有幾個(gè)方式可以盡量清除非特點(diǎn)帶，抗原的量少加一點(diǎn)，我抗原基本上都是1：1000以上，孵育過夜，二抗的量1：20000（上海中杉），故此可以降低上樣量，我通常50-75ug左右，這種前提抗原必須滴度高。
我在抗原上吃過很大的虧，買了兩家公司的抗原，都是進(jìn)口有名的，都沒雜下來(lái)，后來(lái)用了第三家的，就很順利的做下來(lái)了。所以抗原很重要。所以，你首先得排除抗原的問題。我沒做過Ikb-α和OCT-1，所以不敢斷言你用的OCT抗原有問題，不顧第一次做，通常抗體量加多一定，先保證抗原能雜下來(lái)，接出來(lái)再做改善。
3.我指的是我用的試劑盒分離細(xì)胞漿細(xì)胞核組分，那它們?nèi)プ鑫业膶?shí)驗(yàn)包括和EMSA都能檢查目的蛋白。至于那個(gè)試劑盒好用，就不好說了。我用的是國(guó)產(chǎn)碧云天的。
4.通常情況下DTT都是另外配好凍-20度，用時(shí)加。但我在配細(xì)胞裂解液時(shí)就把所有的成份包括DTT配好了，之后分裝-20度保存。用時(shí)也沒發(fā)覺有哪些不妥的。所有，我認(rèn)為應(yīng)當(dāng)沒有哪些大的影響。
