【研究背景】
自然界的蛋白質(zhì)通道在細胞膜上進行分子轉(zhuǎn)運，一般具有極高的選擇性。一個明顯的事例是水通道蛋白家族，它以每秒109個分子的速率輸運水分子，同時敵視離子和質(zhì)子。其它知名的事例包括K+/Na+選擇性為1萬倍的鉀離子通道KcsA以及質(zhì)子的選擇性為其它總價陽離子105倍以上的質(zhì)子通道M2。這種天然通道系統(tǒng)作為仿生物理領(lǐng)域靈感的來源，也對人工通道跨膜傳輸性能設(shè)定了極高的標(biāo)準，對人工通道系統(tǒng)來說無疑是極具挑戰(zhàn)性的。事實上，雖然人工通道在過去四六年中取得了巨大的發(fā)展，迄今為止只有一種人工通道系統(tǒng)才能在功能上真正模仿了天然通道系統(tǒng)，即近來報導(dǎo)的人工水通道，其在保持對鹽和質(zhì)子的高敵視性的同時，在水輸運速度方面超過了水通道蛋白細胞膜水通道，為其輸運速度的2.5倍（Nat..2021,16,911）。近些年來，人工質(zhì)子通道也取得了一些重大進展，對Cl-、Na+和K+的選擇性倍數(shù)分別可達到167.6、122.7和81.5，而質(zhì)子輸運速度高達自然界最快的質(zhì)子通道短球菌肽的1.22倍。不僅這種為數(shù)不多的通道系統(tǒng)外，科研人員努力開發(fā)仿生高選擇性離子通道用于選擇性輸運K+、Na+、Cl-、ClO4-或I-的人工通道，但并沒有取得更大的成功。值得一提的是，雖然目前沒有鈉離子選擇性通道可以在單通道電壓實驗的證明基礎(chǔ)上實現(xiàn)趕超10倍的Na+/K+選擇性，但人工鉀離子通道早已有了明顯的進展，其K+/Na+選擇性從2017年的9.8，2020年的14.0和16.3，2021年的18.2以及2023年的20.1。但是，與天然鉀離子通道KcsA小于1萬倍的K+/Na+離子選擇性相比，這種相對較小的數(shù)字的確表明人工鉀離子通道系統(tǒng)還有巨大的發(fā)展空間。
龍巖學(xué)院曾華強院長課題組提供了一種新穎的基于空間位阻的策略，在提升人工鉀離子通道的鉀/鈉離子輸運選擇性到創(chuàng)紀錄的20.1的同時提升了離子輸運活性。相關(guān)成果近來發(fā)表在Lett上，Doi:10.1016/let.2023.。碩士研究生馬浩文為文章的第一作者，曾華強院長為通信作者。
【圖文簡介】
基于之前的工作，課題組早已證明分子5F8是一個優(yōu)良的K+選擇性通道（圖1a），通過單通道傳導(dǎo)實驗確定了其K+/Na+選擇性為9.8。在(Fmoc-Phe-C4)n的一維晶體結(jié)構(gòu)中，其鏈間的距離值為5.0?，這與利使勁場估算得出的(5F8)n中的鏈寬度離為4.9?較為一致。但該值顯著大于C5中15-冠-5官能團在B3LYP/6-31G*基組下估算得到的分子長度（6.0?，圖1b)，這說明(5F8)n中的冠醚在自組裝的過程中并不是以最穩(wěn)定的構(gòu)型堆疊產(chǎn)生。換句話說，(5F8)n中的冠醚與C5中的冠醚存在一定程度的構(gòu)型區(qū)別。對此作者提出了將兩種空間上互相兼容的大分子絡(luò)合物(苯并冠醚和叔丁基)通過共價鍵聯(lián)接到可將這種大分子絡(luò)合物一維排列在構(gòu)象結(jié)構(gòu)的同右邊的單肽骨架上的策略。因為官能團的作用，同類型的大分子絡(luò)合物(無論是苯冠醚還是叔丁基)之間存在強烈的空間敵視力，因此有利于產(chǎn)生異質(zhì)聚合體。在這種異質(zhì)聚合體中，空間相容的苯冠醚和叔丁基官能團在一維結(jié)構(gòu)的同兩側(cè)呈互相交替的排列，而不是只有單一類型的苯并冠醚或叔丁基的同質(zhì)聚合體。自組裝的同質(zhì)聚合體(5F8)n通過社會自排序過程發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生異質(zhì)聚合體結(jié)構(gòu)(5F10?BF10)n。圖1d是通道分子庫的設(shè)計，通過組合物理篩選可以與BF8配對形成具有提高離子轉(zhuǎn)運活性和選擇性的異質(zhì)聚合體的分子。
圖1.(a)同質(zhì)自組裝結(jié)構(gòu)（5F8）n可能通過社會自選擇過程經(jīng)歷結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變產(chǎn)生異質(zhì)自組裝構(gòu)結(jié)構(gòu)（5F8?BF8）。(b)通過估算得到的Boc中的叔丁基，C5中的15-冠-5和C6中的18-冠-6的分子長度。(c)通過估算獲得的在(5F8?BF8)n結(jié)構(gòu)中，5F8中的15-冠-5和BF8中的叔丁基在空間上具近乎完美的兼容性。(d)通過組合物理優(yōu)化可與BF8配對以形成具有提高離子傳輸活性和選擇性的異質(zhì)組裝體的分子的分子設(shè)計。
離子輸運活性的測試采用包含螢光顏料HPTS的LUV囊泡實驗進行。結(jié)果表明，對富含C8H17或官能團的8個K+選擇性通道，采用該空間位阻策略能使所有通道的鉀離子轉(zhuǎn)運活性明顯提升68%至230%（圖2b,c），非常是對苯丙谷氨酸基通道，其K+/Na+選擇性也得到了明顯的提升（圖2d）。在此輪篩選中，通道(5F10?BF10)n在離子轉(zhuǎn)運活性和選擇性方面均為最佳（圖2d,e）。
Fig.2.(a)用于評估離子通道離子傳輸特點、基于HPTS的LUV囊泡實驗。（b）1.8mmol/L含量下細胞膜水通道，在富含5F10、BF10和MF10的異質(zhì)和同質(zhì)組裝體中觀察到的典型K+輸運曲線。(c)異質(zhì)組裝體((nFm?BFm)n和(nFm?MFm)n)以及同質(zhì)組裝體((nFm)n,(BFm)n和(MFm)n(n=5,6,m=8,10)相對的鉀離子輸運活性(RK+)。(d,e)(nXm?BXm)n和(nXm)n（n=5,6,m=8,10,X=F,L,V,I或A）相對的鉀離子輸運活性(RK+和EC50)。HPTS=8--1,3,6-acid。
進一步采用同樣的方式進行甲基基團的篩選。我們發(fā)覺，羧基的微小變化會極大地提升其K+/Na+選擇性，由此篩選出性能優(yōu)異的異質(zhì)聚合體(5F12?BF12)n（圖3a）。隨即發(fā)覺摩爾比對離子選擇性也形成影響（圖3b），番紅O的電壓敏感實驗驗證了(5F12?BF12)n輸運鉀離子的高選擇性的性能。基于HPTS的活性測定結(jié)果證明，(5F12?BF12)n（n在脂膜中可能等于3）具有極好的K+轉(zhuǎn)運活性，其EC50=1.5μM，相對于脂類分子的摩爾比為1.8mol%，（換算成單通道分子含量則為0.5μmol/L或0.62mol%），其基于單通道電壓測定的K+/Na+選擇性為20.1，為迄今報導(dǎo)的所有鉀離子通道中的最高值。
Fig.3.(a)在2.6mmol/L含量下(5F12?BF12)nI的離子選擇性。(b)總含量為4.9mmol/L，摩爾比為2:1，總含量為5.2mmol/L，摩爾比為1:1和總含量為5.4mmol/L，摩爾比為1:2時，(5F12?BF12)n的離子選擇性(RK+/RNa+)。c)滴加6to7mmol/L的(5F12?BF12)n或0.03to0.05mmol/L的(VA)所造成的番紅O的螢光變化(λex=522nm,λem=581nm;60nmol/L)。LUV囊泡內(nèi)含/LK2SO4，pH為7的10mmol/L的HEPES緩沖液中則含/LK2SO4或100mmol/LK2SO4。t=0時的起始背景硬度F0設(shè)置為1。(d)不對稱浴場中記錄的單通道電壓跡線(cis=0.25mol/LK2SO4;trans=0.25mol/L)。(e)使用線性歐姆電壓-電流（I-V）曲線測定的(5F12)n?(BF12)m的K+/Na+選擇性，該異質(zhì)組裝體在稀含量下可能以各類方式存在。
核磁共振氫譜實驗表明，相對于同質(zhì)組裝體(5F12)n和(BF12)m(圖4a,b)，異質(zhì)組裝體(5F12?BF12)n中的質(zhì)子Ha、Hb、Hc和Hd顯著地向低場位移，分別為0.11、0.05、0.04和0.10ppm，這表明(5F12?BF12)n是由5F12和BF12通過構(gòu)象交替產(chǎn)生。在0.78-50mM范圍內(nèi)，這4種氫原子的物理位移與含量的依賴性都可以用非線性回歸剖析得到較好的擬合，表明了這四種氫原子均參與了絡(luò)合物的產(chǎn)生（圖4c）。對質(zhì)子Ha和Hb的非線性回歸的剖析得出了存在電負性同質(zhì)組裝體(5F12)n的推論(圖4d)，同時，對質(zhì)子Hc和Hd的剖析證明了BF12未能產(chǎn)生良好的自組裝(BF12)n(圖4e)。圖4f-4h的MD模擬結(jié)構(gòu)挺好地否認了上述假定，即使用互相兼容的大官能團(苯并冠醚和叔丁基)通過社會自排序可促使異質(zhì)組裝體例如(5Fm?BFm)n或(6Fm?BFm)n（m=8，10，12等)的產(chǎn)生。
圖4.(a)異質(zhì)組裝體(5F12?BF12)n.的結(jié)構(gòu)。(b)常溫下，(5F12)n,(BF12)n和(5F12?BF12)n含量為/L不同質(zhì)子的相對物理位移。(c,e)在0.78-50mM范圍內(nèi)和常溫下，(5F12?BF12)n,(5F12)n和(BF12)n的質(zhì)子物理位移與含量的關(guān)系。(f,h)(5F12?BF12)3,(5F12)6和(BF12)6在POPC膜里MD模擬的結(jié)構(gòu)。才能產(chǎn)生構(gòu)象距離大于