細胞膜(CMC)色譜技術細胞膜色譜法(CMC)的提出分子細胞生物學的研究表明,受體大分子主要鑲嵌在細胞膜上,屬于整合膜蛋白,其量極微,要得到微克數目級的純品十分困難,所以無法制備純受體固定相。而通過細胞膜制備技術得到含受體細胞膜的CMC法,除了可以克服上述困難,但是最大限度地保持受體分子的立體結構和生物活性,使該色譜系統更接近體內過程。定義:以含受體的細胞膜為固定相,借助溶質分子與相應受體大分子間特異性分子間斥力的不同進行分離測定的氣相色譜技巧。賀浪沖,耿信篤.細胞膜色譜-研究抗生素與受體的新方式.生物醫藥色譜新近展,1996,3:8-9細胞膜色譜法(CMC)的提出基本假定(1)抗生素分子與受體間存在特異性親合力。(2)膜受體大分子表面活性點數與抗生素分子有關。(3)活性點與抗生素可逆結合,并具有立體特異性和飽和性。(4)強溶劑及性質相仿的競爭性抗生素有置換抗生素分子的能力。(5)同類抗生素分子在同一受體上作用位點和硬度存在差異性。(6)抗生素在受體上的作用位點和硬度決定著受體的存在狀態。賀浪沖,耿信篤.細胞膜色譜-研究抗生素與受體的新方式.生物醫藥色譜新近展,1996,3:8-9細胞膜色譜法基本原理CMC:將細胞膜結合到硅膠表面,制成細胞膜固定相(cellphase,CMSP),借助色譜學技術研究流動相中抗生素與受體互相作用規律的受體動力學新方法。
特點:①雙重特點:色譜分離+受體親和②特異性、飽和性:與放射官能團-受體剖析法(RLBA),前沿剖析(FA)進行對比和相關研究③穩定、簡捷、高效捐助:8項國家自然科學基金1項國家自然科學基金重點項目儀器設備要求2.細胞膜色譜固定相3.仿生流動相1.膜受體/蛋白4.進樣器色譜柱裝彈細胞膜制備細胞膜固定相制備5.色譜剖析結果高效氣相色譜儀器設備要求1.細胞膜制備主要設備冷藏高速離心機:>C超聲波清洗機其他設備與器材制冰機渦旋振蕩器電子天平pH計勻漿器儀器設備要求2.細胞固定相制備主要設備電熱鼓風干燥箱真空泵渦旋振蕩器磁力攪拌器高溫冰柜(陳列柜)離心機其他設備與器材電子天平pH計勻漿用具支試管儀器設備要求3.色譜柱制備主要設備裝柱機渦旋振蕩器其他設備與器材高溫冰柜(陳列柜)pH計空色譜柱套裝儀器設備要求4.細胞膜色譜剖析溶劑輸送泵主要設備進樣器高效氣相色譜儀柱溫裝置測量器其他設備與器材高溫冰柜(陳列柜)pH計真空泵操作過程1.細胞膜制備新鮮組織清除血污及附屬組織,剪碎,勻漿細胞懸液液組織勻漿液3000g離心10min細胞膜色譜,傾出堿液,取沉淀用低滲液混懸沉淀,并超聲破膜30min破碎細胞懸液1000g離心10min,取堿液,離心20min,棄堿液細胞膜用低滲液漂洗1次,/LPBS混懸細胞膜懸液操作過程2.細胞固定相制備取活化處理后的大孔硅膠(加適量分散劑)0.05g,于25mL具支試管中,在減壓和震動條件下,將5mL的細胞膜懸液動態加入,反應5min;將反應混和物轉移至10mL離心管中,置4℃條件下攪拌30min后,500rpm離心5min,傾去堿液,沉淀用預冷的生理鹽水漂洗1次,500rpm離心,棄去堿液,加等容積的10mmol/L磷絡合物緩沖液(pH7.4),渦旋回落混勻細胞膜色譜,4℃放置過夜,即得細胞膜固定相懸液。
操作過程3.細胞膜色譜柱制備制備螺絲流速約2mL/min,調整流速,勻漿罐使裝柱機柱前壓力穩定在10MPa左右,維持5min。儲液瓶流速調節表壓力表裝柱機柱套篩板細胞膜色譜的主要應用?用于從草藥復雜體系中篩選出活性成份?用于草藥復方的物質基礎剖析?用于研究抗生素與受體的親和作用?受體亞型抗生素的篩選細胞膜色譜聯用技巧的提出原CMC法存在的問題隨著對CMC法基礎研究的深入和應用領域的擴大,急切須要對其進行“升級換代”的提升,并具備新的剖析功能。比如原CMC法中:第一,靶細胞是通過生物組織和通常培養方式獲得的,靶細胞質膜上的“目標”受體抒發數目有限且不可控,促使對官能團辨識的靈敏性和選擇性遭到了不同程度的限制;第二,靶細胞質膜上“目標”受體的低抒發,致使色譜固定相表面的非均勻性質提高,卟啉與膜受體間結合反應性減小,對復雜體系中微量或痕量成份的辨識有一定困難;第三,采用的單通道/單檢查剖析系統,致使對活性成份的鑒別不能同步在線進行,系統的在線定性和定量功能相對較弱等。